УДК 576 - Сибирский Научно-Исследовательский институт
реклама
УДК 576.8:575.2 ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ВАРИАНТЫ ПРОМЫШЛЕННОГО ШТАММА LACTOBACILLUS PLANTARUM 28 Я.Р.Каган, И.Я.Сергеева, Е.Ф.Отт ГНУ Сибирский научно-исследовательский институт сыроделия Россельхозакадемии, Барнаул В 1970-х годах научный сотрудник ВНИИМС К.П.Алексеева (г. Углич) выделила из состава незаквасочной микрофлоры зрелого высококачественного сыра «Костромской» штамм лактобацилл подрода Streptobacterium, обозначенный впоследствии как Lactobacillus plantarum 28. Выделенный штамм выгодно отличался от других изолятов стрептобактерий, а также уже имевшихся в коллекции штаммов L.plantarum, рядом производственно-ценных свойств, а именно: - энергичным ростом и кислотообразованием в молоке и достаточно быстрым (для данного вида лактобацилл) образованием молочного сгустка с хорошими органолептическими показателями; - выраженным антагонизмом по отношению к бактериям группы кишечных палочек и маслянокислым бактериям; - стабильным отсутствием в экспериментальных сырах, выработанных с включением в закваску этого штамма, признаков маслянокислого брожения, а также такого распространенного в сырах этой группы порока, как «горький привкус» [1]. Благодаря этим свойствам, особенно его высокой антагонистической активности, штамм L.plantarum 28 стал интенсивно использоваться в сыроделии. В частности, на его основе сотрудниками ВНИИМС был разработан бакпрепарат «Биоантибут» [2], предназначенный для защиты от маслянокислого брожения сыров с низкой температурой второго нагревания в весенний и осенний периоды года, когда наблюдается повышенное содержание в перерабатываемом молоке спор маслянокислых бактерий. Позднее, учитывая способность штамма быстро снижать рН при культивировании в растительных субстратах в сочетании с выраженным специфическим антагонизмом, его стали включать в состав отечественных биоконсервантов для сенажа и силоса [3, 4]. Обработка сочных кормов этими биоконсервантами приводила к снижению потерь их питательной ценности (вследствие полного подавления гнилостных процессов в растительной массе) и, что особенно важно для сыроделия, к ингибированию развития в кормах маслянокислых бактерий. Крупномасштабное культивирование штамма L.plantarum 28 и его массовая интродукция в окружающую среду при отсутствии поддерживающего отбора не остались безнаказанными: антагонистическая активность штамма начала снижаться, а на ряде сыродельных заводов страны появились специфичные для него вирулентные бактериофаги. В связи с вышесказанным в лаборатории микробиологии СибНИИС (г. Барнаул) проведены исследования, направленные на более детальное изучение этого штамма и выяснения возможности получения у него генетически модифицированных вариантов. Установлено, что по морфологии и основным физиолого-биохимическим свойствам штамм соответствует типовому описанию вида L.plantarum [5]. Микроскопический препарат: мелкие (0,9-1,0 мк х 3-5 мк) ровные палочки с закругленными концами, расположены одиночно и в коротких цепочках (рис. 1а). На поверхности АГМ (агар с гидролизованным молоком) образует круглые выпуклые светло-серые колонии, диаметром от 0,5 до 2 мм (в зависимости от густоты посева), в глубине полужидкого агара (АГМ с агара) колонии в виде «гвоздиков» (рис. 1б, в). Стерильное обезжиренное молоко свертывает за 38-40 ч (при 1 % инокулюме) с образованием ровного сметанообразного сгустка (без отделения сыворотки) кислотностью 60-62 оТ. Предельная кислотность в молоке – 138 оС. Хорошо растет в растительных средах, например, за 20 ч инкубации в отваре донника (характеризующегося выраженными буферными свойствами) снижает рН с 7,0 до 4,8. Температурные пределы роста 15-40 ºС, оптимум 30-37 ºС. Штамм ферментирует глюкозу без образования газа (гомоферментативный тип ферментации), ферментирует также лактозу, маннозу, раффинозу, сахарозу, целлобиозу и (слабо) крахмал, не ферментирует арабинозу, рамнозу, сорбозу, ксилозу и рибозу. L. plantarum 28 утилизирует цитрат с выделением газа, аммиак из аргинина не образует. Популяционный анализ кислотообразующей и цитратферментирующей способностей штамма выявил относительно высокую гомогенность штамма (средний диаметр зон просветления вокруг колоний на агаре с мелом и агаре с цитратом кальция соответственно 3,8 ± 0,1 мм и 2,9 ± 0,2 мм) [6]. Штамм демонстрирует устойчивость к хлориду калия и натрия (предельные концентрации в питательной среде, допускающие рост штамма, соответственно 9 и 8 %). Определение минимальных ингибирующих концентраций (МИК) ряда антибиотиков для L. plantarum 28 дало следующие результаты: пенициллин – 1,0 ЕД, ампициллин – 0,1 ЕД, стрептомицин – 10 мкг/см3, канамицин – 10 мкг/см3, гентомицин – 50 мкг/см3, эритромицин – менее 2 мкг/см3 и левомицетин – 10 мкг/см3. Генетический анализ обнаружил в клетках штамма наличие 4 криптических (т.е., с неустановленной функцией) плазмид с молекулярной массой 2,0, 5,6, 8,6 и 38,0 т.п.н. [5]. Штамм проявляет довольно высокую фагоустойчивость: в экспериментах по его типированию 86 видоспецифическими вирулентными бактериофагами из коллекции СибНИИС коэффициент фагочувствительности штамма составил 0,12 [7]. Для получения генетически-модифицированных вариантов промышленного штамма L. plantarum 28 использовали разные методические приемы. Получение антибиотикоустойчивых мутантов. Главной целью получения антибиотикоустойчивых мутантов L. plantarum 28 была перспектива их последующего использования в качестве носителей селективных маркеров в исследованиях, связанных с определением их численности в смешанных популяциях лактобактерий (метод индикаторных штаммов) [6]. После нескольких циклов пассирования исходного штамма в питательной среде с возрастающими концентрациями стрептомицина был выделен спонтанный мутант, обозначенный 28-СУ, который проявлял на 2 порядка более высокую устойчивость к данному антибиотику, чем исходный штамм (1000 мкг/см3 против 10 мкг/см3). Стрептомицинустойчивый мутант (Strr-мутант) сохранил морфологические и физиолого-биохимические свойства своего исходного штамма, в том числе спектр ферментации углеводов и уровни чувствительности к другим вышеуказанным антибиотикам, однако несколько снизил кислотообразующую способность (свертывание молока после 72 ч инкубации с образованием слабого сгустка; предельная кислотность 118 оТ). Для придания штамму повышенной устойчивости к эритромицину применили модифицированную нами методику межродового (р.Lactococcus/р.Lactobacillus) конъюгационного переноса гена, кодирующего этот признак (Eryr). Донором послужил штамм лактококков L. lactis ТК7 (из коллекции СибНИИС), несущий «эритромициновую» плазмиду pEL1 и, в отличие от штамма-реципиента (L. plantarum 28), неспособный ферментировать сахарозу (Suc-). Колонии рекомбинантов отбирали по фенотипу Eryr Suc+. Таким образом при определенных условиях спаривания получили несколько рекомбинантных колоний, сравнительный анализ которых показал, что все они являются Eryr-трансконъюгантами реципиентного штамма L.plantarum 28. Выход Eryr-трансконъюгантов в расчете на 1 клетку реципиента составил 3,0.10-8. Конъюгационный перенос плазмиды pEL1 вызвал повышение устойчивости клеток-хозяев к эритромицину в 100-200 раз, по сравнению с уров- нем устойчивости у исходного штамма. Как и в случае с приобретением стрептомицинустойчивости, у большинства полученных Eryr-трансконъюгантов произошло некоторое ослабление кислотообразующей активности [8]. Интересно отметить, что у всех полученных нами вышеуказанных антибиотикоустойчивых вариантов штамма L.plantarum 28 наблюдалось заметное повышение антагонистической активности по отношению к тест-штамму E. coli 125 [6]. Получение мутантов с повышенной антагонистической активностью. Целью этих исследований было получение у штамма L. plantarum 28 вариантов с повышенной, по сравнению с исходным уровнем, антагонистической активностью в отношении маслянокислых бактерий. Для индукции таких мутантов применили метод химического мутагенеза с использованием супермутагена N-нитрозо-N-метилмочевины (концентрация 0,1 %, экспозиция 2 ч). Антагонистическую активность мутантов оценивали визуально по подавлению или степени задержки газообразования при их совместном культивирования с тестштаммом C. tyrobutyricum Г1. В общей сложности после проверки 3108 клонов, происходящих из мутагенизированных клеточных популяций L.plantarum 28, отобрали 6 мутантов, стабильно сохраняющих повышенный антагонизм. Два из них обладали наибольшей активностью, вызывая у тест-штамма полное подавление газообразования (мутант С5-11) или задержку начала газообразования на 4 суток (мутант С3-11). Оба мутанта проявляют повышенный антагонизм и по отношению к тест-штамму кишечной палочки (диаметр зоны ингибирования 15-16 мм против 13 мм у исходного штамма) [6]. Полученные антагонистически-активные мутанты не отличались от исходного штамма по морфологии и основным физиолого-биохимическим признакам; они имели одинаковые спектры ферментации углеводов и идентичные фаготипы [6]. Получение фагоустойчивых вариантов. Установлено, что исходный штамм L.plantarum 28 проявляет чувствительность к 7 тест-фагам, полученным из коллекции ВНИИМС (Р4, Р7, Р9, Р13, Р15, Р21 и Р23), а также к 5 «алтайским» фагам мезофильных лактобацилл [9]. После посева на поверхность агаровой среды клеточной суспензии исходного штамма, обработанной N-нитрозо-N-метилмочевиной (концентрация 1 %, экспозиция 2 ч, температура 30 оС) и смешанной с препаратом фага Р4, была выделена колония мутанта 28ФР (ПФ5), который, как оказалось, устойчив не только к фагу Р4, но и к 6 остальным фагам ВНИИМС, вирулентным для исходного штамма. Дальнейшая проверка показала, что мутант 28ФР (ПФ5) приобрел устойчивость и к «алтайским» фагам, вирулентных для исходного штамма, а именно: он полностью нечувствителен к 4 фагам (φv92, φv242, φv247 и φv331) и дает ослабленную реакцию лизиса с фагом φv305. Отсутствие у фагоустойчивого мутанта 28ФР (ПФ5) спонтанной или вызванной УФ-излучением индукции фагочастиц, вирулентных по отношению к исходному штамму, показало, что фагоустойчивость мутанта 28ФР (ПФ5) не связана с его лизогенизацией фагом Р4 [9]. Фагоустойчивый мутант 28ФР (ПФ5) сохранил все производственно-ценные признаки исходного штамма L.plantarum 28, включая способность к активному росту и кислотообразованию в молочных и растительных средах, высокую солеустойчивость и выраженный антагонизм к технически-вредной микрофлоре. Поэтому он может заменить исходный штамм L.plantarum 28 в соответствующих крупнотоннажных ферментациях с целью снижения риска нарушения хода технологического процесса, связанного с фаговой инфекцией [9]. Перечень полученных нами генетически-модифицированных вариантов промышленного штамма L.plantarum 28 представлен в таблице. Таблица. Генетически-модифицированные варианты промышленного штамма L.plantarum 28 №№ Целевой Метод Индекс Усиление выра- признак получения мутанта 1 Устойчивость к стрептомицину 28 СУ 2 Антагонизм по отношению к маслянокислым бактериям Пассирование в среде с возрастающими концентрациями стрептомицина, отбор спонтанных мутантов Индуцированный хемомутагенез (N-нитрозо-Nметилмочевина) 3 4 Устойчивость к эритромицину Межродовая (р.Lactococcus/р.Lactobacillus) конъюгация Фагоустойчивость Индуцированный хемомутагенез (N-нитрозо-Nметилмочевина) женности целевого признака 100 раз С3-11 Задержка развития C.tyrobutyricum Г1 на 4 суток (по сравнению с исходным штаммом) С5-11 Полное подавление развития C.tyrobutyricum Г1 100 раз ПК18 28ФР (ПФ5) Полная устойчивость к 11 из 12 тест-фагов, вирулентным по отношению к исходному штамму; ослабление литической реакции у фага φv305 Представленные данные свидетельствуют о возможности генетической модификации промышленного штамма L.plantarum 28, обеспечивающей улучшения уже имеющихся у него производственно-ценных свойств либо придающей ему новые признаки. Задача заключается в выборе признаков, нуждающихся в изменении в соответствии с запросами производства, и разработке оптимальных методических путей получения этих изменений. Полученные нами мутанты промышленного штамма L.plantarum 28 включены в коллекцию отраслевых микроорганизмов лаборатории микробиологии СибНИИ сыроделия (раздел «генетически-модифицированные штаммы). Библиографический список 1. Алексеева К.П. Применение молочнокислых палочек - антагонистов маслянокислых бактерий при производстве сыра. Автореф. дисс. канд. техн. наук. Углич-Киев, 1971. 21 с. 2. ТУ 49 493-83 «Препарат бактериальный сухой «Биоантибут». Технические условия». 3. ТУ 49 368-76 «Бактериальная закваска ВНИИМС-ИНБИ для силосования кормов. Технические условия». 4. ТУ 10.0625.24-93. «Препарат бактериальный для силосования кормов «БКС-1». Технические условия». 5. Buchanan R.E., Gibbons N.E. (co-eds) Bergey`s manual of determinative bacteriology, eighth ed. The Williams and Wilkins Comp.- Baltimore, 1974, 1268 pp. 6. «Разработать и внедрить технологический процесс высококонцентрированных бакпрепаратов на основе генетически-модифицированных штаммов, обеспечивающих по- лучение сыров высокого качества», раздел «Мутагенез антагонистически-активных штаммов лактобацилл». Отчет АФ ВНИИМС о НИР 862.159.90.04. Рук. Я.Р.Каган. Барнаул, 10090. 116 с. 7. Обидина Н.В., Каган Я.Р., Сергеева И.Я. Комплексная селекция лактобацилл для биоконсервантов растительных кормов. Сб.науч.тр. СибНИИС СО РАСХН, в.4, «Актуальные проблемы техники и технологии переработки молока», Барнаул, 2007, с. 162-170. 8. Каган Я.Р., Сергеева И.Я., Отт Е.Ф. Межродовой конъюгационный перенос плазмиды pEL1 в промышленные штаммы Lactobacillus plantarum и некоторые свойства Eryr-трансконъюгантов. Мат.Межрег.н-прак. конф., посвященной 90-летию А.Г.Гриневич, Иркутск, 2004, с. 25-27. 9. Каган Я.Р., Сергеева И.Я., Обидина Н.В. Характеристика промышленного штамма Lactobacillus plantarum 28 и его фагоустойчивого мутанта. Сб.науч.тр. СибНИИС СО РАСХН, в.3, «Актуальные проблемы техники и технологии переработки молока», Барнаул, 2006, с. 95-104. Реферат УДК 576.8:575.2 ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ВАРИАНТЫ ПРОМЫШЛЕННОГО ШТАММА LACTOBACILLUS PLANTARUM 28 Я.Р.Каган, И.Я.Сергеева, Е.Ф.Отт ГНУ Сибирский научно-исследовательский институт сыроделия Россельхозакадемии, Барнаул Дано краткое описание промышленного штамма L.plantarum 28 и его генетическимодифицированных вариантов, отличающегося от исходного штамма повышенным антагонизмом по отношению к тест-культурам маслянокислых бактерий и кишечной палочки, фагоустойчивостью и устойчивостью к некоторым антибиотикам.
