Бигликан регулирует экспрессию и сарколемную локализацию дистробревина, синтрофина и NО.

Бигликан регулирует экспрессию и сарколемную локализацию дистробревина, синтрофина и NО.
Белковый комплекс дистрофина ( БКД ) обеспечивает важнейшую связь между базальной мембраной и
цитоскелетом в скелетных мышцах. Он состоит из трех подкомплексов : дистрофин и дистрогликаны ( α - , β ); саркогликаны ( α - , β - , γ - δ - ) – саркоспан; и цитозольный дистробревин –синтрофин-NО (1, 2).
Дистрофин связывает актин и цитоплазматический хвост β - дистрогликана. α - дистрогликан в свою очередь
соединяется с β - дистрогликаном с ламинином , агрином , перлеканом и бигликаном (2, 3). Поддержание
связи важно для поддержания функции скелетных мышц и их стабильности. На клеточном уровне мутации в
генах кодирующих белков DAPC вызывают дестабилизацию DAPC , потерю целостности мембраны, и
дегенерацию мышечных волокон ( 4 , 5). Ранее мы показали, что молекула ECM бигликан экспрессируется на
поверхности скелетных мышц и связывается с белком DAPC α - дистрогликаном (3). Бигликан является
членом семьи небольших лейцин - богатых
протеогликанов ( SLRP ). Оно содержит в своей
последовательности 38 кДа полипептид с 10 лейциновыми повторами в окружении двумя богатыми
цистеином доменами и двух участков гликозаминогликана ( ГАГ) на его NH2 -конце. Бигликан - дефицитные
мыши , как было показано, снизили темпы роста, а также наблюдалось снижение костной массы ( впервые
обнаружено в возрасте 6 мес ) и преждевременный остеоартрит ( 6, 7). Мышцы экспрессируют и "
протеогликан " (PG) и полипептидное "ядро". Бигликан, как было показано, играет роль в развитии
скелетных мышц и регенерации. Это повышает регуляцию во время регенерации мышечных волокон, и
мыши с дефицитом бигликана имеют задержку регенерации после травмы (8). Кроме того, мыши,
сверхэкспрессирующие бигликан, продемонстрировали развитие аберрантных мышц (9). Тем не менее, не
известно, как внеклеточный бигликан влияет на процессы, которые влияют на сигнализацию внутри
мышечной клетки и как бигликан влияет на состав DAPC. Здесь мы показываем , что взрослые мыши с
отсутствием бигликана проявляют мягкий дистрофический фенотип, показывая увеличение дегенерации и
регенерации мышечных волокон, ненормальное распределение размеров волокон и слабость мышечной
оболочки. Исследование DAPC элементов показало селективное снижение локализации α - дистробревина -1 и
-2 , α - и β1 – синтрофина и NО в сарколемме . Экзогенный бигликан побудил перелокализация нОАС из
цитозоля в плазматическую мембрану в культуре бигликан-дефицитных мышечных клеток. Наконец,
внутримышечные (IM ) инъекции рекомбинантного бигликана восстановило экспрессию α – дистробревина 1, α - дистробревина -2 и β1 –синтрофина в сарколемме бигликан нулевых мышей. Таким образом, бигликан
важен для поддержания целостности мышечных клеток и играет непосредственную роль в регуляции
экспрессии и сарколемной локализации внутриклеточного DAPC α - дистробревина - 1 и -2 , α - и β1 синтрофина и NО сигнализации.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Экспрессия и очистка рекомбинантного бигликана.
Рекомбинантный бигликан был произведен с использованием стабильной трансфекции в линию 293- EBNA
клеток. Клеточная линия была создана путем передачи бигликана полигистидином слитой конструкции,
первоначально созданного для экспрессии с использованием системы экспрессии вируса осповакцины в
рСЕР4 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA , США) вектор экспрессии. Полученную в результате плазмиду
трансфицировали в 293- EBNA клетки и отобрали устойчивые клетки при культивировании в присутствии
гигромицина В. После амплификации клетки высевали в биореакторе Celligen Plus (New Brunswick Scientific,
Edison, NJ , США) , содержащем 100 г Fibra – Cel с возрастанием до насыщения. Продуцирование белка было
инициировано путем замены культуральной среды в модифицированной Дульбекко среде без сыворотки
Дульбекко ( DMEM ) . После концентрации кондиционированной среды с помощью тангенциальной
проточной системы Pellicon 2 ( Millipore Corporation , Bedford, MA , США), рекомбинантный бигликан
очищали с использованием никелевой хелатирующей хроматографии и элюированием градиентом 0-250 мМ
имидазола в 20 мМ Трис-HCl , 500 мМ NaCl , 0,2% CHAPS , рН 8,0 . Полипептид бигликана с "
протеогликаном" и с "основными" глюкохаминогликанами затем отделяли от протеогликана после
анионообменной хроматографии и элюции с линейным градиентом 0.15-2 М NaCl в ЗФР , 0,2% CHAPS .
Следует отметить, что обе формы N- гликозилированные (10).
Антитела.
Были использованы следующие первичные антитела : анти- бигликан (клоны 2A5 и 4C6 ) ( Creely др. ,
неопубликованные результаты . ), анти - дистробревин (BD Transduction Laboratories) ( Сан-Хосе ,
Калифорния , США), изоформы конкретных антител к синтрофину SYN259 ( α - syntrophin ) , SYN29 ( β2 syntrophin ) и SYN37 ( β1 - syntrophin ) (11) ⇓ , антитела к дистробревину 638 ( α - dystrobrevin - 1) , и DB2 ( α dystrobrevin -2 ) (12) ⇓ , анти- NО ( Immunostar , Хадсон , Висконсин , США) , анти -6- 10 дистрофин ( щедрый
подарок от Тимоти Дж. Байерс и Луис M. Kunkel ( Гарвардской медицинской школа детской больници ,
Бостон, Массачусетс , США ) , анти- меросин ( Alexis Biochemicals , Сан-Диего, Калифорния, США ) и NCLdys2 ( дистрофин ), NCL- г - SARC ( γ - саркогликана ) , NCL- б - SARC ( β - саркогликана ) и NCL- а- SARC (
α - саркогликана ) ( Novocastra , Ньюкасл на Тайн, Великобритания ).
Были использованы следующие вторичные антитела : . Alexa 488 - козы против IgG кролика , Alexa 488 антимышиный IgG (Molecular Probes , Eugene , OR, США ) , Cy3 - козьи антитела против кроличьего IgG (
Jackson Immunoresearch , West Grove , PA, USA) козьи антитела с пероксидазой хрена против кроличьего IgG,
и козьи антитела с пероксидазой хрена против мышиных IgG (Amersham , Piscataway, NJ , USA).
Производство антител к бигликану ( Ab ).
Моноклональные антитела, способные обнаруживать бигликан иммуногистохимически, были произведены.
Взрослым бигликан-дефицитным мышам вводили вакцины virus/T7 бактериофага экспрессирюющие ядро и
протеогликаны форм бигликана (Sigma , Сент-Луис , Миссури , США ) . Проводились шесть повторных
инъекций. Гибридома, секретирующая антитела, которые окрашивали дикий тип, срезы не бигликан дефицитных мышц считались положительным и субклонировали. Моноклональные антитела 2A5 и 4C6 были
использованы в настоящем исследовании.
Мембранные препараты скелетных мышц.
Четырехглавую мышцу 5- WK- старых мышей гомогенизировали в буфере, содержащем 0,3 М сахарозы , 35
мМ Трис (рН 7,4) , 10 мМ ЭДТА , 10 мМ EGTA , коктейль ингибиторов протеаз (Roche Applied Science ,
Indianapolis , IN, USA) , и азид натрия. Образцы обрабатывают ультразвуком на льду в течение 3 × 10 с и
центрифугируют при 7000 г при 4 ° С в течение 20 мин. Твердый KCl был добавлен до конечной
концентрации 0,6 М и образцы центрифугировали 7000 г в течение 20 мин . Мембраны затем собирают
центрифугированием в течение 140 000 г в течение 60 мин при 4 ° С. Концентрация белка определяется
бицинхониновой кислотой ( Pierce, Rockford, IL , США).
Вестерн-блот анализ.
Белки были переведены на нитроцеллюлозные мембраны в буфере для переноса при 100 V в течение 1 ч при
4 ° С. Мембраны блокировали TBS , 0,1% Твин-20 , 4,0 % нормальной козьей сывороткой, 5,0 % молоке в
течение 1 ч при комнатной температуре и инкубировали с первичным Ab в блокирующем буфере в течение
ночи при 4 ° С. Мембраны промывали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с козьим
анти- кроличьими или анти- IgG мышинными конъюгированными с пероксидазой хрена ( Amersham
Biosciences ), разбавленными 1:1000 в блокирующем буфере. После промывки граница Ab была обнаружена с
помощью усиленной хемилюминесценции в соответствии с протоколом производителя ( Amersham ).
Бигликан нулевые мыши.
У бигликан-дефицитных мышей были получены путем вставки PGK - нео кассеты из вектора ООПТ в экзоне
2 на месте Tth111I как описано (6). Оригинальные C57BL / 6 фоновые мыши скрешивали, а затем обратно
скрещивали с C3h на протяжении нескольких поколений, чтобы создать конгенных животных (14) и были
получены от Jackson Labs ( Bar Harbor, ME , США) . Аналогичные результаты наблюдались в обоих возрастах.
( В предварительных экспериментах мы наблюдали , что дикий тип и бигликан нулевые мыши C57BL / 6
дали результаты неотличимые от фоновых животных. ) Животных содержали при комнатной температуре с
24 ч -дневным циклом и кормили гранулами и водой. Все протоколы были проведены в строгом соответствии
с официальным одобрением Комитета институциональному уходу и использованию животных университета
Брауна.
Количественный анализ полимеразной цепной реакции ( ПЦР).
Выделение РНК из р35 четырехглавой мышцы проводили с использованием метода тризола ( Invitrogen ,
Карлсбад, Калифорния , Карлсбад, Калифорния , США). Очищенную РНК превращали в кДНК с
использованием набора Superscript III First- Strand Synthesis System (Invitrogen , Carlsbad, CA , USA). КПЦР
реакцию проводили с использованием SYBR - зеленого метода (Invitrogen) на ABI PRISM 7300 в режиме
реального времени. Грунтовки были разработаны с использованием DS Gene праймера разработки
программного обеспечения ( Accelrys , Сан-Диего , Калифорния , США) . АТФ-синтаза была использована для
нормализации. Анализ данных проводили с использованием стандартного метода кривой (15). Все
эксперименты проводились в трех экземплярах с помощью трех пар мышей дикого типа и бигликан нулевых.
Используемые праймеры: 5'- TGG ГАА ААТ CGG ACT СТТ ТГ- 3 ' ; 5'- АГТ AAC CAC хлорамфеникол
ацетилтрансфераза (КПП) GGG СТТ ТГ- 3 ' ; α - синтрофин , 5'- AAG CTG AGG ATC GTT CAT C -3 ' ; α синтрофин 5'- TCA GGC TGG TCT КТГ АГ-3 '; β1 - синтрофин, 5'- ГАА CAG AGA GGC ПКК ТТГ CC -3 ' ; β1
- синтрофин 5'- хлорамфеникола ацетилтрансфераза ГТГ ACT ССТ ТАА ацетил- коферментакарбоксилаза
(АКК) ТГ- 3 ' ; β2 - синтрофин 5'- GCA АСА АСА AAG AAG С- 3 ' ; β2 - синтрофин
5'CCT GTT ГТГ GTC CAG CAG ТГ- 3 ' ; α - дистробревин -1, 5'- TGA AGA АСА CAG GCT GAT CG- 3 ' ; α дистробревин -1: 5'- GCA TCG ATG ГТГ AAG ГАГ АТ-3 '; α - дистробревин - 2 вперед , 5'- ССТ СТТ GTC ТТГ
TTC ССТ ГТГ- 3 ' ; α - дистробревин -2 Реверс: 5'- CAG CGC ССТ ААА AAC AGA AA- 3 ' ; ННО вперед, 5'GGG CAA АСА GTC TCC TAC СА-3 '; ННО обратно : 5'- AGG ГТГ TCA ГТГ AGG ACC AC- 3 ' .
Окрашивание синим красителем Эванса и креатинкиназа сыворотки.
10 мг / мл раствор голубого Эванса красителя в PBS инъецировали в хвостовую вену мышей дикого типа ,
бигликан -дефицитных и MDX мышей. Четырехглавые мышцы были собраны через 3-6 ч и сделаны
криосекции. Синий краситель Эванса -положительные мышечные волокна наблюдались под флуоресцентным
микроскопом , используя набор родаминовых фильтров. Сто мышечных волокон в секции для каждой из трех
мышей на генотип были подсчитаны. Для измерений КФК в сыворотке собирали кровь анестезированных
животных ретро-орбитального кровотечения со сгустками , а уровни фермента были измерены с
использованием коммерческого набора (Sigma) .
Гистология и иммуногистохимия
Четырехглавая мышца бедра была выделена и замораживали в жидком изопентане охлажденном азотом. Во
всех экспериментах 10 мкм срезы ровесников конгенных BGN ноль и дикого типа мышей были установлены
на том же слайде. Срезы фиксировали 4% параформальдегидом свежеприготовленным в течение 5 мин при
комнатной температуре, блокированной в блокирующем реагенте в течение 1 ч при комнатной температуре и
инкубировали с указанными первичными Aт ночь при 4 ° С с последующей инкубацией с вторичными Aт в
течение 1 ч при комнатной температуре.
Вектор M.O.M.
Базовый комплект использовали в соответствии с протоколом производителя. Срезы установлены в
Permafluor ( Thermo Electron Corporation, Pittsburgh, PA , США) и анализировали с помощью конфокальной
лазерной сканирующей микроскопии ( Leica TCS SP2 акустооптического светоделитель ( AOBS ) . Иммунного
окрашивание не наблюдалось , IgG или значения Aт были заменены первым слоем; исследование также
показало, что вторичные антитела видоспецифичны. Все изображения для сравнения , представленные здесь,
были захвачены со срезов BGN нуль и дикого типа мышц , которые были установлены на том же слайде
изображения с помощью программного обеспечения Leica LCS. Срезы наблюдались также с использованием
Nikon ( Мелвилл , Нью-Йорк , США).
Клеточные культуры.
Бигликан-дефицитная линия мышечных клеток была создана с использованием утвержденных протоколов
(16). Бигликан нулевые клетки выращивали до ~ 75% слияния на покрытых желатином Permanox
chamberslides ( Nalge Nunc , Naperville , Иллинойс, США ) при 33 ° С и 10% углекислого газа в ростовой среде
, содержащей модифицированную Dilbecco Eagle ( DMEM) с высоким содержанием глюкозы (КЗС ), 20% FBS
, 2% экстрактом куриного эмбриона , 1% L-глутамина , 1% пенициллина / стрептомицина , и 1U INF - γ .
Клетки дифференцированы 4-9 дней в среде, содержащей DMEM высокий Glc , 5% лошадиную сыворотку ,
1% L-глутамин и 1% пенициллин / стрептомицин.
Иммуноцитохимия
Дифференцированные бигликан -нулевые клетки инкубировали в течение 4 ч при 33 ° С с 0,7 нМ.
Ацетилхолин (АХ ) рецепторы были помечены родамин - α - бунгаротоксином в течение 30 мин при 33 ° С
Дальнейшая инкубация была завершена при комнатной температуре и клетки промывали в MEM -H после
каждого шага . Клетки фиксировали в 1 % параформальдегиде и 0,05% сапонина. Для обнаружения нОАС
клетки инкубировали с первичном Aт в течение 1 ч, затем инкубируют с козьими анти - мышиными IgG
Alexa 488 течение 1 часа. Клетки фиксировали метанолом в течение 5 мин при -20 ° С ( Vector Laboratories,
Burlinghame , CA , USA). Изображения были получены на микроскопе Nikon Eclipse E800 с использованием
60. Сегменты без каких-либо поверхностно- локализованных нОАС получили оценку 0 и сегмент с
наибольшей степенью получил 4 .
Внутримышечные инъекции бигликан.
Пятьдесят мкг очищенного рекомбинантного бигликана в 50 мкл 20 мМ Трис, 0,5 М NaCl , 0,2% CHAPS , рН
8.0/1.0 % вводили внутримышечно в правую четырехглавую мышцу бедра 2- недельных старых бигликан
нулевых мышей с использованием 29 1/2G инсулинового шприца (BD Biosciences , Сан-Хосе , Калифорния ,
США). Пятьдесят мкл 20 мМ Трис , 0,5 М NaCl, 0,2 % CHAPS , рН 8.0/1.0 % вводили в левую четырехглавую
мышцу бедра каждого животного, чтобы служить в качестве внутреннего контроля. Инъецированные
четырехглавый мышцы были выделены через 4, 7, 11 и 14 дней после инъекции бигликана. Инъекции у 2 –
недельных старых животных были проведены с использованием трех BGN нулевые пометов. Увеличение α дистробревина -1, α - дистробревина -2 , β1 - синтрофина и β2 - синтрофина через 11 дней после инъекции
наблюдалось у 4 из 4 животных и увеличение через 14 дней после инъекции наблюдали в 4 из 4 животных .
Никакого увеличения не наблюдалось ни в одной из контрольных мышц. Для иммуногистохимической
маркировки мышечной ткани , четырехглавые мышцы бедра были выделены как описано выше. Срезы были
дважды подвергнуты действию моноклональных антибигликановых антител 2А5 или 4C6 и кроличьих
поликлональных антител против указанного дистробревина или синтрофина (см.
Антитела ) . Вторичные антитела, используемые для обнаружения: Alexa Fluor 488- козы против IgG мыши и
Cy-3 козьих антител против кроличьего IgG в разведении 1:2000 .
РЕЗУЛЬТАТЫ
Бигликан-дефицитные мыши обнаруживают дистрофический фенотип.
Мутации в любом из нескольких компонентов DAPC вызвают широкий спектр мышечных дистрофий ( 5 , 17
). Бигликан связывается с тремя компонентами: α - дистрогликаном, α - саркогликаном и γ - саркогликаном (3)
(MS Rafii , Х. Хагивара , и JR Fallon , неопубликованные результаты ). Мы проверяли, действительно ли
отсутствие бигликана у мышей вызывает дистрофию (рис. 1 ). Во-первых, мы провели анамиз поглощения
синего красителя Эванса для определения целостности мембран мышц находится под угрозой. Бигликан
нулевым мышам и дистрофин нулевым MDX мышам внутривенно вводили синий краситель Эванса и
оценивали степень поглощения в скелетных мышечных волокнах после 6 часов. Мышечные клетки дикого
типа имели малую проницаемость (< 0,5% клеток ) , в то время как > 90% MDX мышечных волокон показали
поглощение красителя (18) (рис. 1А ) . Бигликан нулевые волокна отображают промежуточное состояние.
Одна популяция волокон была полностью проницаема и показала равномерное распределение красителя
(7,4% ± 1,3 ; п = 3) , тогда как другие показали околомембранное распределение. Эта локализация на
периферии клетки не наблюдалось у контрольных мышц из помета дикого типа. Измерение сывороточных
уровней КФК также показало умеренную сарколемную проницаемость у бигликан нулевых мышей . Мы
наблюдали уровни 240 ± 43 , 870 ± 104 и 6435 ± 385 для дикого типа , бигликан дефицитных и MDX мышей ,
соответственно ; U / L , ± SE, п = 3) . Таким образом, субпопуляции мышечных волокон у бигликан нулевых
мышей показывают свидетельство дырявых мембран и потери целостности сарколеммы.
Мы рассмотрели гистологию мышц от бигликан нулевых мышей . Как показано на рис. 1B, большинство
волокон в бигликан нулевых мышцах были аналогичны дикому типу, о чем можно судить по окрашиванию
гематоксилином и эозином . Тем не менее, доля мышечных волокон у бигликан нулевых мышей имеют
центрально локализованные ядра, отличительная черта регенерирующих волокон ( 5.08 % ± 0,58 и 9,65 % ±
1,34 в четырехглавой и диафрагмы , соответственно). В отличие от волокон <0,5% волокон у животных дикого
типа имели центральные ядра. Подобный процент ядер в центре волокна были обнаружены в четырехглавой
мышцы у 4 - , 12 - и 24- недельных с отсутствием бигликана (данные не показаны). Мы не наблюдали
обширную клеточную инфильтрацию мононуклеаров или фиброз у бигликан нулевых мышц. Аномальные
мышцы часто характеризуются повышенной изменчивостью размера волокон. Поэтому мы измеряли диаметр
волокон четырехглавой мышцы бедра, икроножной мышцы и диафрагмы (рис. 1С ). В четырехглавой и
икроножной бигликан нулевых мышцах волокна были меньше, чем у дикого типа. Средний диаметр волокна в
четырехглавой мышце дикого типа был 36,89 ± 3,88 мкм против 30,56 ± 2,73 мкм в
бигликан нулевых мышцах. Средний диаметр волокна в икроножной мышце дикого типа был 38,14 ± 4,69 мкм
против 33,67 ± 3,52 мкм при отсутствие бигликана. С другой стороны, диафрагма из бигликан нулевых мышей
отображает более широкий гранулометрический состав волокна (фиг. 1C). Средний диаметр размера волокна
в мышцах дикого типа диафрагмы был 23,20 ± 3,08 мкм против 27,89 мкм ± 5.21 мкм в диафрагме с
отсутствием бигликана. Взятые вместе, эти результаты показывают, что бигликан- нулевые мыши
обнаруживают умеренный дистрофический фенотип.
Селективное восстановление α - дистробревина , синтрофина.
Мы сравнили экспрессию отдельных DAPC белков у взрослых дикого типа и бигликан нулевых мышей . Во
всех случаях мы сравнивали бигликан нулевых мышей с нормальными или конгенными, подобранными по
возрасту животными дикого типа. Результаты были совместимы между животными. Сначала мы исследовали
уровни экспрессии дистрофина, основных трансмембранных комплексов, и ламинин α2 . Как показано на рис.
2, иммунофлуоресцентное окрашивание срезов мышц показало, что сарколемная экспрессия дистрофина и α , β - , и γ - саркогликана остается неизменной у бигликан нулевых животных. Экспрессия α - и β дистрогликана и α2 цепи ламинина были также неразличимы у всех групп мышей (рис. 2).
Мы также использовали иммуногистохимию, чтобы изучить экспрессию внутриклеточных DAPC белков,
участвующих в передаче сигналов. В каждом эксперименте мы также подвергли ткани иммуноокрашиванию
для дистрофина, который является неизменным и таким образом служит в качестве внутреннего,
положительного контроля (рис. 2 ⇓ и рис. 3 ⇓ А, В). Как показано на рис. 3A, α-дистробревин-1 и -2 сильно
экспрессированы в мышечной сарколемме дикого типа мышц. Кроме того, эти белки локализованы
внепрерывно, непрерывно распределены на сарколемме. В противоположность этому, у BGN нулевой
мышцы, α-дистробревин-1 и -2 выражены на более низком уровне в сарколемме и распределены нерегулярно,
точечным рисунком.
Мы также отметили, что α - синтрофин и β1 - синтрофин снижаются в сарколемме бигликан -дефицитных
животных (рис. 3А). С другой стороны, экспрессия β2 - синтрофина в сарколемме бигликан нулевой мышцы
не отличалась от мышей дикого типа. Внутриклеточный уровень всех трех синтрофинов был увеличен в
бигликан нулевых по сравнению с мышцами дикого типа (рис. 3а, б). Как показано на рис. 3А, сарколемные
уровни ННО были ниже в бигликан нулевых мышцах, чем у мышей дикого типа. Взятые вместе, эти
результаты показывают, что существует селективное восстановление в экспрессии комплекса дистробревинсинтрофин- нОАС в сарколемме бигликан нулевых мышей. Практически все компоненты DAPC
экспрессируются в нервно-мышечном соединении. Кроме того , люди с нарушениями денервации показали
специфические изменения в паттернах экспрессии этих синтрофинов и дистробревинов, но не остальную
часть DAPC (21). Таким образом, мы спросили , была ли изменена экспрессия α - дистробревина ,
синтрофина и нОАС в синапсах в бигликан нулевой мышце. Мы считаем, что уровни экспрессии и
распределения α - дистробревина -1 , α - дистробревина -2 , α - синтрофина , β1 - синтрофина , β2 - синтрофина
и ННО остаются неизменными в бигликан нулевых нервно-мышечных синапсах ( данные не представлены) .
Таким образом, этот DAPC подкомплекс уменьшается в сарколемме но поддерживается в нервно-мышечном
соединении. Нарушение регуляции α - дистробревина -1 и -2 , α - , β1 - и β2 - синтрофина , и ННО
мембранных фракций из бигликан нулевой мышцы. Иммуногистохимические данные , описанные выше,
показывают, что уровни α - дистробревина -1 и -2 уменьшены на плазматической мембране бигликан дефицитных мышечных волокон. Чтобы определить, изменяется ли биохимический профиль этих белков , мы
оценили свои уровни в KCl - промытых тяжелых микросомальных мембранных фракций , которые являются
смесью плазмы и внутриклеточных мембран (22). Чтобы сравнить уровни мембран-связаного дистробревина,
мы выделили фракции от дикого типа и бигликан нулевых четырехглавых мышц и исследовали их с помощью
пан- специфических анти-дистробревин антител. Рисунок 3С показывает, что уровни как α - дистробревин -1
и -2 уменьшены в этих мембранных фракциях. Мы рядом исследовали экспрессию α - , β1 - и β2 синтрофинов в KCl - промытых мембранных фракциях. Иммуноблоттинг с изоформами -специфических
антител показал, что уровни всех трех синтрофинов были увеличены в мембранных фракциях при отсутствии
бигликана по сравнению с контролем дикого типа (фиг. 3C). Это повышенная экспрессия, вероятно, отражает
вклад синтрофинов связанных с внутриклеточными мембранами; действительно, это находится в согласии с
нашим иммуногистохимическими результатами показывая повышенные внутриклеточные уровни всех
синтрофинов в бигликан нулевых мышцах (рис. 3а, б). Эти результаты показывают, что бигликан служит для
соответствующего целевого прикрепления синтрофина к поверхности мышечных клеток и / или регулировать
внутриклеточный транспорт этих молекул. Мы также сравнили экспрессию нОАС дикого типа и бигликан
нулевых. Как показано на рис. 3C, уровни экспрессии нОАС в мембранах бигликан нулевых животных
снизилась по сравнению с диким типом, в согласии с иммуногистохимическими
результататами. Избирательные изменения β1 - синтрофина и уровней экспрессии мРНК ННО в скелетных
мышцах бигликан нулевых мышей.
Количественный анализ ПЦР в реальном времени ( QRT -PCR) показал, что транскрипты β1 - синтрофина
значительно повышали регуляцию у бигликан нулевых мышей по сравнению с диким типом ( 1,88 ± 0,27
против 1,00 , P < 0,03 , Т критерий Стьюдента ) , в то время уровни транскриптов ННО регулируются по
принципу отрицательной обратной связи ( 0,18 ± 0,27 против 1,00 , р <0,03 , Т -критерий Стьюдента ) . С
другой стороны , уровни обоих α - дистробревинов и α -и β2 - синтрофинов эквивалентны дикому типу и
бигликан нулевым мышцам.
Бигликан вызывает перераспределение нОАС к плазматической мембране.
Мы разработали систему для культивирования клеток для дальнейшего изучения роли бигликана в
ориентации DAPC компонентов к поверхности клетки. Мы культивировали бигликан -дефицитные мышечные
трубки и инкубировали их либо с очищенным рекомбинантным полипептидом ядром бигликана или только
наполнителем в течение 4 часов . Мышечные трубочки были помечены родамин - α - бунгаротоксином для
визуализации АХР и разграничения плазматической мембраны. Затем мы фиксировали и подвергли
иммунному окрашиванию на наличие дистробревинов , синтрофинов и нОАС . Как показано на рис. 5, ННО
распределяется по всей цитоплазме в необработанных клетках , с небольшой маркировкой, наблюдаемой в
области плазматической мембраны. Тем не менее, лечение бигликаном повышает уровни локализованного
ННО. Мы количественно оценили это перераспределение нОАС путем присвоения каждой ячейке баллов (0-4
0 - отсутствие, 4 самый высокий уровень нОАС на поверхности), представляющих степень присутствующего
на поверхности нОАС. При отсутствии бигликана, средний балл составил 2,0 ± 0,11 ; в присутствии
бигликана, средний балл 2,94 ± 0,12 . Гистограмма на рис. 5B отображает количество неочищенных или
бигликан обработанных клеток. Эти данные показывают, что лечение BGN нулевых мышечных трубок ядром
бигликана увеличивает количество нОАС на мембране ( P <0,01 ; тест Колмогорова-Смирнова ).
В параллельных экспериментах мы отметили, что окрашивание α - дистробревина -1 и -2 и β2 - синтрофина
присутствует внутри клетки. С другой стороны, были экспрессированы α - синтрофин и β1 - синтрофин по
всей клетке , в том числе в поверхностно - проксимальном расположении. Тем не менее, лечение бигликаном
не изменяет локализацию этих белков.
Инъекция очищенного бигликана восстанавливает экспрессию α - дистрофинов и β - синтрофинов в
сарколемме BGN нулевых мышечных волокон в естественных условиях.
Результаты, описанные выше, показывают, что подкомплекс DAPC уменьшается в сарколемме взрослых BGN
нулевых мышей. Однако, поскольку отсутствует бигликан в ходе развития, то невозможно определить, когда
бигликан играет роль в локализации этих компонентов. Кроме того, поскольку бигликан выражен в других
местах , в том числе костях и сухожилиях ( 23 , 24) , то возможно, что фенотип имеет вторичный дефект в
другой ткани. Наконец, результаты у BGN нулевых мышей не позволяют определить, что требуется (ядро или
протеогликан ) для направления правильной локализацию DAPC
подкомплекса. Очищенный
рекомбинантный полипептид бигликан, ядро или протеогликан (50 мкг ), инъецировали в правую
четырехглавую мышцу бедра 2- WK- старых BGN нулевых животных. Буфер о вводили в левую
четырехглавую мышцу, чтобы представить контроль внутри животного. Место
инъекции визуализировали путем метки тушью. Четырехглавую мышцу рассекали через 4, 7, 11 и 14 дней
после инъекции, делали срезы и проводили иммунологическое исследование.
Внутримышечно вводят ядро бигликан, что оказывает поразительное влияние на экспрессии синтрофинов и
дистробревинов в BGN нулевой мышце. К 11 дней после инъекции , мы наблюдаем повышенную экспрессию
α - дистробревина -1 и -2 и β1 - и β2 - синтрофина в сарколемме. Кроме того, повышенная экспрессия этих
внутриклеточных DAPC белков показало тесную пространственную корреляцию с экзогенным бигликаном
(рис. 6а -D). Повышающей регуляции не наблюдалась при введении (рис. 6А -D ) ядра или протеогликанов
бигликана ( данные не показаны). Увеличение α - дистробревина -1 и -2 и β1 - и β2 - синтрофина сохранялась
на 14 дней после инъекции. Мы не наблюдали изменения в α - синтрофина после инъекции. В самом деле,
есть свидетельства, что механическая травма индуцирует экспрессию ННО в мозге (25). Взятые вместе, эти
результаты показывают, что бигликан может быть доставлен в мышцы в естественных условиях , и что он
может направить локализацию α - дистробревинов и β - синтрофинов к сарколемме . Таким образом, бигликан
может регулировать экспрессию комплекса дистробревин-синтрофин на сарколемме в естественных
условиях.
ОБСУЖДЕНИЕ
В этом исследовании мы демонстрируем, что BGN нулевые мыши имеют мягкую мышечную дистрофию, и
обеспечивают несколько линий доказательств , что это внеклеточный белок регулирует локализацию и
экспрессию подмножества внутриклеточных DAPC компонентов в скелетных мышцах. Более того, наши
данные показывают, что механизмы, лежащие в бигликанопосредованной экспрессии синтрофинов,
дистробревинов и нОАС , вероятно, будут различны. Здесь мы обсуждаем доказательства, подтверждающие
эти выводы, потенциальные основные механизмы и последствия этих выводов для потенциальной терапии
для мышечной дистрофии . Бигликан-дефицитные мышцы отображают мягкую мышечную дистрофию и
характеризуются повышенной КФK сыворотки и поглощения синего красителя Эванса , увеличение числа
централизованных ядер в волокнах, и ненормальным распределением размеров миофибрилл. Мембрана была
наиболее пострадавшей у ~ 10 % волокон , показывающих центральные ядра. Эти особенности, наблюдаемые
на 5 неделе, не были прогрессивными и не сопровождались мононуклеарной клеточной инфильтрацией. Стоит
отметить, что этот фенотип качественно подобен тому, что наблюдается у α - дистробревин нулевых мышей (
которые также показывают снижение ННО на сарколемме ; реф 26 ⇓ ) . В этом случае наблюдается ~ 50%
центральных ядер, но мало мононуклеарной инфильтрации был замечено и в целом дистрофия значительно
менее серьезна, чем в MDX. мыши с дефицитом α - синтрофина показали снижение сарколемной экспрессии
α - дистробревина-2 и нОАС , но не имели миопатических симптомов ( 27, 28). Наконец, α - дистробревин -1
как было показано, связывается с промежуточной нитью белка десмусина и
синколина[ Ньюи , 2001 ; Блейк , 2002 ]. Поэтому возможно, что защита мембраны мышечных клеток
дистробревинами от сжатия, вызвающего повреждение структурной связи DAPC с цитоскелетом. Вместе эти
результаты показывают, что снижение уровня α - дистробревина , по крайней мере частично , лежит в основе
дистрофического фенотипа наблюдаемого у BGN нулевых мышей. Наши результаты показывают, что
различные механизмы лежат в основе снижения дистробревинов , синтрофинов и нОАС на сарколемме BGN
нулевых мышей. Иммуногистохимическое окрашивание и Вестерн блот общего числа мембран мышечных
клеток показали снижение α - дистробревина -1 и -2 (рис. 3). Кроме того, уровни транскриптов являются
неизменными (рис. 4). В настоящее время не известно, связано ли это посттранскрипционное сокращение
дистробревина с повышенным распадом или уменьшением транскрипции. Поскольку уровни дистрофина
являются неизменными у этих мышей, снижение дистробревина может быть связано с недистрофин
опосредованной ассоциации с мембраной ( 28,29,30) и / или дефектной сигнализацией. С другой стороны ,
ННО, по-видимому, регулируется на уровне транскрипции в естественных условиях, так как мРНК,
кодирующая этот белок уменьшается > 5 раз по сравнению с контрольной группой. Бигликан может также
регулировать ННО адресность, так как лечение мышечных трубок очищенным бигликаном индуцирует и
увеличение мембраной ассоциации этого фермента. Тем не менее, следует подчеркнуть, что в естественных
условиях и культуре клеток эксперименты весьма различны. Например, DAPC в культивируемых мышечных
трубках рудиментарен в лучшем случае, с фрагментарной базальной пластинкой и существенной
внутриклеточной экспрессией нОАС и саркогликанов (29, 31). Нарушение регуляции синтрофинов у BGN
нулевых мышей сложный процесс. Все синтрофины имеют нарушеный внутриклеточный синтез как
свидетельствует увеличение внутриклеточной локализации и повышенной экспрессии в KCl - промытых
мембранах. Внутриклеточное накопление синтрофинов предполагает, что эти белки были нацелены на
мышечную оболочку через другой механизм, чем используемый остальной частью DAPC. Действительно,
предыдущая работа показала, что дистрофин и синтрофин имеют разные маршруты во время ориентации на
мембране (32). Синтрофины перевозятся в пост-гольджи везикулах, которые путем экзоцитоза сливаются с
мембраной, в то время как дистрофина становится непосредственно связаны с сарколемме после синтеза.
Синтрофины также показали отличную регуляцию транскрипции : транскрипты α - и β2 - синтрофинов были
неизменными, в то время как β1 - мРНК были повышены (рис. 4). Наконец , изменения в экспрессии
сарколеммы различаются в зависимости от синтрофинов : β1 - синтрофин показывает наиболее заметное
снижение , в то время как α - синтрофин снижается в меньшей степени и β2 - был неотличим от дикого типа.
Таким образом, в то время как экспрессия всех синтрофинов страдает у мутантных мышей, бигликан особенно
важен для регулирования β1 - синтрофина. Механизм, посредством которого бигликан индуцирует сигналы
сарколемной локализации дистробревин - синтрофин подкомплекса или предотвращает внутриклеточное
накопление синтрофинов не известен. Бигликан связывается с α - дистрогликаном через его боковые цепи
ГАГ (3). Тем не менее, полипептид ядра бигликана активен в нашей культуре клеток и в естественных
условиях, предполагая, что наблюдавшиеся эффекты не могут быть опосредованы α - дистрогликаном. Кроме
того, поскольку экспрессия дистрофина не меняется в бигликан -дефицитных мышцах, маловероятно, что
потеря сайтов связывания синтрофина и дистробревина дистрофина является причиной их неправильной
локализации. Комплекс саркогликана может быть очищен от дистробревина и синтрофина в отсутствие
дистрогликана или дистрофина (31). Кроме того, коиммунопреципитацией подтверждено и другие
эксперименты в нашей лаборатории показали, что полипептид ядра бигликана связывается с α - и γ саркогликаном ( Х. Хагивара , М. Rafii , Дж. Фаллон , неопубликованные наблюдения ) . Таким образом,
привязки бигликана к саркогликаном, возможно, в комплексе , который не содержит дистрофин, могут стать
частью трансмембранного комплекса, с помощью которого эта матрица белка регулирует локализацию
комплекса дистробревин - синтрофин - ННО. Наконец, мы показали, что внутримышечное введение
очищенного основного полипептида бигликана может восстановить сарколемную экспрессию
α дистробревина -1 и -2 , и β1 - и β2 – синтрофина у BGN нулевых мышей. Этот результат демонстрирует, что
бигликан может непосредственно вызывать увеличение экспрессии белка и / или перелокализацию DAPC
белков из цитоплазмы в плазматическую мембрану. Это также показывает, что внутримышечно вводимый
бигликан соответственно локализуется в перимизии и сарколемме и стабильно ассоциируется с этими
сайтами на срок до 2 недель после введения. Эти фармакокинетические свойства бигликана, в сочетании с его
способностью индуцировать специфические изменения в локализации некоторых DAPC компонентов в
мышцах, позволяют предположить, что он является потенциальным терапевтическим агентом для мышечной
дистрофии.
Ссылки
↵ Metzinger, L., Blake, D. J., Squier, M. V., Anderson, L. V., Deconinck, A. E., Nawrotzki, R., Hilton-Jones, D., Davies, K.
E. (1997) Dystrobrevin deficiency at the sarcolemma of patients with muscular dystrophy. Hum. Mol. Genet. 6,11851191
↵ Blake, D. J., Weir, A., Newey, S. E., Davies, K. E. (2002) Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related
proteins in muscle. Physiol. Rev. 82,291-329
↵ Bowe, M. A., Mendis, D. B., Fallon, J. R. (2000) The small leucine-rich repeat proteoglycan biglycan binds to alphadystroglycan and is upregulated in dystrophic muscle. J. Cell Biol. 148,801-810
↵ Ahn, A. H., Kunkel, L. M. (1993) The structural and functional diversity of dystrophin. [Review]. Nat. Genet. 3,283291 CrossRef Medline
↵ Cohn, R. D., Campbell, K. P. (2000) Molecular basis of muscular dystrophies. Muscle Nerve 23,1456-1471 CrossRef
Medline
↵ Xu, T., Bianco, P., Fisher, L. W., Longenecker, G., Smith, E., Goldstein, S., Bonadio, J., Boskey, A., Heegaard, A. M.,
Sommer, B., Satomura, K., Dominguez, P., Zhao, C., Kulkarni, A. B., Robey, P. G., Young, M. F. (1998) Targeted
disruption of the biglycan gene leads to an osteoporosis-like phenotype in mice. Nat. Genet. 20,78-82 CrossRef
Medline
↵ Ameye, L., Young, M. F. (2002) Mice deficient in small leucine-rich proteoglycans: novel in vivo models for
osteoporosis, osteoarthritis, Ehlers-Danlos syndrome, muscular dystrophy, and corneal diseases. Glycobiology
12,107R-116R
↵ Casar, J. C., McKechnie, B. A., Fallon, J. R., Young, M. F., Brandan, E. (2004) Transient up-regulation of biglycan
during skeletal muscle regeneration: delayed fiber growth along with decorin increase in biglycan-deficient mice.
Dev. Biol. 268,358-371 CrossRef Medline
↵ Hayashi, Y., Liu, C. Y., Jester, J. J., Hayashi, M., Wang, I. J., Funderburgh, J. L., Saika, S., Roughley, P. J., Kao, C. W.,
Kao, W. W. (2005) Excess biglycan causes eyelid malformation by perturbing muscle development and TGF-alpha
signaling. Dev. Biol. 277,222-234 CrossRef Medline
↵ Hocking, A. M., Strugnell, R. A., Ramamurthy, P., McQuillan, D. J. (1996) Eukaryotic expression of recombinant
biglycan. Post-translational processing and the importance of secondary structure for biological activity. J. Biol.
Chem. 271,19571-19577
↵ Peters, M. F., Adams, M. E., Froehner, S. C. (1997) Differential association of syntrophin pairs with the dystrophin
complex. J. Cell Biol. 138,81-93
↵ Peters, M. F., Sadoulet-Puccio, H. M., Grady, M. R., Kramarcy, N. R., Kunkel, L. M., Sanes, J. R., Sealock, R.,
Froehner, S. C. (1998) Differential membrane localization and intermolecular associations of alpha-dystrobrevin
isoforms in skeletal muscle. J. Cell Biol. 142,1269-1278
↵ Ramamurthy, P., Hocking, A. M., McQuillan, D. J. (1996) Recombinant decorin glycoforms. Purification and
structure. J. Biol. Chem. 271,19578-19584
↵ Goldberg, M., Septier, D., Rapoport, O., Iozzo, R. V., Young, M. F., Ameye, L. G. (2005) Targeted disruption of two
small leucine-rich proteoglycans, biglycan and decorin, excerpts divergent effects on enamel and dentin formation.
Calcified Tissue Int. 77,297-310 CrossRef Medline
↵ Winer, J., Jung, C. K., Shackel, I., Williams, P. M. (1999) Development and validation of real-time quantitative
reverse transcriptase-polymerase chain reaction for monitoring gene expression in cardiac myocytes in vitro. Analyt.
Biochem. 270,41-49
↵ Morgan, J. E., Beauchamp, J. R., Pagel, C. N., Peckham, M., Ataliotis, P., Jat, P. S., Noble, M. D., Farmer, K.,
Partridge, T. A. (1994) Myogenic cell lines derived from transgenic mice carrying a thermolabile T antigen: a model
system for the derivation of tissue-specific and mutation-specific cell lines. Dev. Biol. 162,486-498 CrossRef Medline
↵ Hack, A. A., Groh, M. E., McNally, E. M. (2000) Sarcoglycans in muscular dystrophy. Microsc. Res. Tech. 48,167-180
CrossRef Medline
↵ Matsuda, R., Nishikawa, A., Tanaka, H. (1995) Visualization of dystrophic muscle fibers in Mdx mouse by vital
staining with Evans blue: evidence of apoptosis in dystrophin-deficient muscle. J Biochem. Tokyo 118,959-964
↵ Brenman, J. E., Chao, D. S., Gee, S. H., Mcgee, A. W., Craven, S. E., Santillano, D. R., Wu, Z. Q., Huang, F., Xia, H. H.,
Peters, M. F., Froehner, S. C., Bredt, D. S. (1996) Interaction of nitric oxide synthase with the postsynaptic density
protein PSD-95 and alpha 1-syntrophin mediated by PDZ domains. Cell 84,757-767 CrossRef Medline
↵ Kameya, S., Miyagoe, Y., Nonaka, I., Ikemoto, T., Endo, M., Hanaoka, K., Nabeshima, Y., Takeda, S. (1999) alpha1syntrophin gene disruption results in the absence of neuronal-type nitric-oxide synthase at the sarcolemma but does
not induce muscle degeneration. J. Biol. Chem. 274,2193-2200
↵ Compton, A. G., Cooper, S. T., Hill, P. M., Yang, N., Froehner, S. C., North, K. N. (2005) The syntrophin-dystrobrevin
subcomplex in human neuromuscular disorders. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64,350-361 Medline
↵ Mitchell, R., Palade, P., Fleischer, S. (1983) Purification of morphologically intact triad structures from skeletal
muscle. J. Cell Biol. 96,1008-1016
↵ Fisher, L. W., Termine, J. D., Young, M. F. (1989) Deduced protein sequence of bone small proteoglycan I (biglycan)
shows homology with proteoglycan II (decorin) and several nonconnective tissue proteins in a variety of species. J.
Biol. Chem. 264,4571-4576
↵ Rees, S. G., Flannery, C. R., Little, C. B., Hughes, C. E., Caterson, B., Dent, C. M. (2000) Catabolism of aggrecan,
decorin and biglycan in tendon. Biochem. J. 350,181-188
↵ Saxon, D. W., Beitz, A. J. (1994) Cerebellar injury induces NOS in Purkinje cells and cerebellar afferent neurons.
NeuroReport 5,809-812 Medline
↵ Grady, R. M., Grange, R. W., Lau, K. S., Maimone, M. M., Nichol, M. C., Stull, J. T., Sanes, J. R. (1999) Role for alphadystrobrevin in the pathogenesis of dystrophin-dependent muscular dystrophies. Nat. Cell Biol. 1,215-220 CrossRef
Medline
↵ Adams, M. E., Kramarcy, N., Krall, S. P., Rossi, S. G., Rotundo, R. L., Sealock, R., Froehner, S. C. (2000) Absence of
alpha-syntrophin leads to structurally aberrant neuromuscular synapses deficient in utrophin. J. Cell Biol. 150,13851398
↵ Crawford, G. E., Faulkner, J. A., Crosbie, R. H., Campbell, K. P., Froehner, S. C., Chamberlain, J. S. (2000) Assembly of
the dystrophin-associated protein complex does not require the dystrophin COOH-terminal domain. J. Cell Biol.
150,1399-1410
↵ Abdelmoity, A., Padre, R. C., Burzynski, K. E., Stull, J. T., Lau, K. S. (2000) Neuronal nitric oxide synthase localizes
through multiple structural motifs to the sarcolemma in mouse myotubes. FEBS Lett. 482,65-70 CrossRef Medline
↵ Crosbie, R. H., Barresi, R., Campbell, K. P. (2002) Loss of sarcolemma nNOS in sarcoglycan-deficient muscle. FASEB
J. 16,1786-1791
↵ Yoshida, M., Hama, H., Ishikawa-Sakurai, M., Imamura, M., Mizuno, Y., Araishi, K., Wakabayashi-Takai, E., Noguchi,
S., Sasaoka, T., Ozawa, E. (2000) Biochemical evidence for association of dystrobrevin with the sarcoglycan-sarcospan
complex as a basis for understanding sarcoglycanopathy. Hum. Mol. Genet. 9,1033-1040
↵ Marchand, S., Stetzkowski-Marden, F., Cartaud, J. (2001) Differential targeting of components of the dystrophin
complex to the postsynaptic membrane. Eur. J. Neurosci. 13,221-229 CrossRef Medline
Переведено проектом МОЙМИО: www.mymio.org
Оригинал статьи: http://www.fasebj.org/cgi/content/full/20/10/1