Стратегия обогащения клеток с MGMT (P140K) для пересадки в скелетные мышцы.

Стратегия обогащения клеток с MGMT (P140K) для пересадки в скелетные мышцы.
Antonio S. J. Lee1, Prathibha Kahatapitiya1, Belinda Kramer1, Josephine E. Joya2, Jeff Hook1, Renjing Liu2, Galina
Schevzov1,3, Ian E. Alexander4, Geoff McCowage5, Didier Montarras6, Peter W. Gunning1,3,7, Edna C. Hardeman2,8,§,*
Article first published online: 5 FEB 2009
DOI: 10.1002/stem.28
Введение
Клеточная заместительная терапия с использованием стволовых клеток в настоящее время вышла на первый план
медицинской науки. В сочетании с генной терапией, трансплантация стволовых клеток является потенциальным
лечения условий, которые влияют на широкий спектр заболеваний, включая расстройства центральной нервной
системы, таких как болезнь Паркинсона, мышечных расстройств, таких как мышечная дистрофия, или рака, такого
как лейкемия. В настоящее время трансплантация гемопоэтических стволовых клеток в сочетании с генной терапией
является наиболее устоявшейся формой клеточной терапии. Высокий уровень успеха трансплантации
гемопоэтических стволовых клеток в основном достигнут за счет эффективной доставки донорских клеток через
кровеносную систему в костном мозге. Кроме того, обеспечены получение высоко пролиферативных
гемопоэтических стволовых клеток в результате эффективной в естественных условиях пролиферации и
существенные уровни приживления донорских клеток. Новейшие разработки в области трансплантации
гемопоэтических стволовых клеток привели к стратегии выборочного обогащения клеток донора с преимуществом
в выживании в тканях реципиента путем специальной обработки.
Большинство химиотерапевтических агентов имеют нежелательный побочный эффект- миелосупрессию, что
приводит к подавлению иммунной системы. Стратегии для селективного обогащения донорских гемопоэтических
стволовых клеток для улучшения приживления первоначально были разработаны для лечения миелосупрессии. Есть
много исследований, которые изучали различную лекарственную устойчивость в естественных условиях для
выбора стратегии обогащения, среди которых, наиболее эффективная стратегия использует ген-опосредованной
резистентности О6-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы (MGMT) (P140K) [14 -19]. MGMT (P140K), который
является мутантной формой гена MGMT лекарственной устойчивости. MGMT имеет возможность восстановить,
вызванное химиотерапией алкилирование ДНК, тем самым делая химиотерапевтические препараты
неэффективными для лечения рака [20, 21]. Применение O6 бензилгуанина (O6BG) в комбинации с химиотерапией
приводит к торможению MGMT, делая химиотерапевтические препараты более эффективными. . Стратегия
обогащения MGMT (P140K)-опосредованных донорских стволовых клеток опирается на комбинированние
цитотоксического действия алкилирующей химиотерапии плюс O6BG на эндогенные стволовые клетки хозяина и
лекарственную устойчивость пересаженных клеток, экспрессирующих MGMT (P140K). Это стратегия была
продемонстрирована для достижения 75% -100% приживления донорских клеток.
Скелетные мышцы не так хорошо применимы для трансплантации клеток, как кроветворная система, несмотря на
их способность к быстрой регенерации после травмы. Трансплантация стволовых клеток скелетных мышц
изучалась с 1980-х [25-27]. Первое применение трансплантации стволовых клеток мышц была проведена у
мышиной модели мышечной дистрофии Дюшенна (МДД) и привели к формированию мышечных волокон
экспрессирующих дистрофин. Однако последующее клиническое применение трансплантации стволовых клеток в
мышцы не показали существенных функциональных улучшений у пациентов с МДД. Неэффективное приживление
было связано с гибелью клеток донора сразу же после трансплантации в результате иммунного отторжения и / или
конкуренции эндогенных клеток и неэффективной миграции донорских клеток от места инъекции для широкого
приживления.
В этом исследовании, мы проверяем возможность применения MGMT (P140K)-опосредованной селективной
стратегии обогащения для трансплантации клеток в скелетные мышцы как органа выбора. Мы показали, что клетки
с присвоенной лекарственной устойчивостью могут быть выборочно обогащены в пробирке и сохраняются в
естественных условиях после введения химиотерапевтического агента, 1,3-бис (2-хлорэтил)-1-нитрозомочевины
(BCNU) в сочетании с O6BG. Сингенная трансплантация подтвердила преимущество выживания лекарственноустойчивых клеток донора и привело к формированию де-ново волокон мышцы. Кроме того, после приживления,
пересаженная популяция гетерогенных лекарственно-устойчивых клеток донора в состоянии вести эндогенную
регенерацию.
Материалы и методы.
Клеточная культура и ретровирусная трансдукция.
C2C12 клеток и миобластов человека культивировали, как описано ранее. MFG-MGMT-P140K ретровирусные
векторы были построены с использованием ретровирусной основы MFG, как описано ранее. Векторный супернатант
собирали из РА317 клеток, трансфицированных MFG векторной плазмидой и подвергли препарат обработке с
использованием 10 мкМ O6BG (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, http://www.sigmaaldrich.com) и 100 мкМ BCNU
(Bristol-Myers-Squibb, Noble Park North, Австралия, http://www.bmsa.com.au). Для трансдукции C2C12 клеток и
миобластов, векторный супернатант использовали как замену культуральной среды в течение ночи, прежде чем
заменить нормальной средой роста на следующий день.
Инъекция нотексина животным.
Все хирургические процедуры были одобрены Детским медицинским научно-исследовательским институтом и
Комитетом по этике, и проведены в соответствии с австралийским кодексом практики по уходу и использованию
животных в научных целях. Мышей анестезировали кетамином (0,1 мг / г, б. Мас.), и ксилазином (0,01-0,02 мг / г б.
Мас.) и 1-см разрез кожи был сделан либо на передней или задней поверхности задних конечностей.
Для исследования в естественных условиях, чтобы определить влияние BCNU и O6BG на регенерацию мышц, 0,2
мкг Нотексина (40 мкг / мл: Latoxan, Valence, Франция, http://www.latoxan.com) и 0,1-0,5 мг BCNU (33,3 мг / мл)
смешивают и вводят внутримышечно (10 мкл) в длинный разгибатель пальцев (EDL) с использованием 50-мкл
шприца (Hamilton компании, Reno, NV, http:// www.hamiltoncompany.com). После восстановления от анестезии,
O6BG (30 мг / кг массы тела в PEG400) вводили внутрибрюшинно.
Для выделения донорских клеток , 8-12-недельным самцам C57BL/6JArc дикого типа или MGMT- трансгенным
мышам вводили 0,1 и 0,4 мкг нотексина внутримышечно в EDL и переднюю большеберцовую (TA) мышцу ,
соответственно. Мышцы были собраны через 3 дня для изоляции донороских клеток .
Выделение донорских клеток CD34 +
Протокол был принят Montarras и соавт. и выбор CD34 + клеток был выполнен с помощью магнитного EasySepPE разделения клеток Kit (Stem Cell Technologies, Ванкувер, Британская Колумбия, Канада, http://www.stemcell.com)
в соответствии с инструкциями изготовителя с анти-CD34 биотинилированными антителами (eBioscience Inc, San
Diego, CA, http://www.ebioscience.com; 1:50).
Трансплантация донорских CD34 + VE клеток в сочетании с BCNU (IV) и O6BG (IP)
Реципиентам женского пола C57BL/6JArc мышам дикого типа (8-12-недельного возраста) вводят внутримышечно
донорские CD34 + клеток (60.000 клеток в 5 мкл стерильной PBS) смешиванные с 5 мкл нотексина (40 мкг / мл).
При каждой пересадке реципиенту, в большую подкожную вену был выставлен катетер на задней поверхности
задних конечностей и был помещен жгут для временной блокировки притока крови [40] и BCNU (0,2 мг в 50 мкл)
вводили внутривенно. После инъекции стерильными ватный тампон был размещен для предотвращения
кровотечения, в то время как приток крови был заблокирован в течение 2 минут. После восстановления от
анестезии, O6BG (30 мг / кг массы тела) была доставлена внутрибрюшинно.
Иммунохимия и флуоресцентная гибридизация
Иммунодетекция α-актинина-2 была выполнена, как описано ранее, и обнаружение MGMT и дистрофина
проводили с помощью мышинного комплекта (Vector Laboratories, Burlingame, CA, http://www.vectorlabs.com; номер
продукта FMK -2201) в соответствии с инструкциями изготовителя с первичными антителами: анти-человеческими
MGMT (Neomarkers, Фремонт, штат Калифорния, http://www.labvision.com, 1:100) и антидистрофиновыми
антителами (NCL-DYS, Novocastra, Ньюкасл-апон-Тайн, Великобритания, http://www.novocastra.co.uk, 1:200).
Флуоресцентная гибридизация (FISH) была выполнена как описано ранее .
Вестерн блотанализ.
Вестернблотанализбылвыполненкакранее описано.Первичные антитела использовались к антисаркомерному
тропомиозину,анти –а-актину2,анти- MyoD .
Флуоресценная сортировка клеток
Изолированные клетки фиксировали в 1% параформальдегиде в течение 30 минут и промывают в FACS буфере
(PBS, 0,1% BSA, 0,1% азида Na) и в 0,1% Твин-20 в течение 1 часа при 37 ° C (для обнаружения внутриклеточных
маркеров). Клетки инкубировали со следующими первичными антителами : анти-CD34 биотинилированные
антитела (eBioscience Inc, San Diego, CA, http://www.ebioscience.com, 1:100) в течение 30 минут при 4 ° С, мышинные
анти-человеческие
моноклональные
антитела,
MGMT
(Neomarkers,
Фремонт,
штат
Калифорния,
http://www.labvision.com, 1:25) в течение 2 часов при температуре 4 ° С, анти-мышиные CXCR4 FITCконъюгированные антитела (R & D Systems, Minneapolis , http://www.rndsystems.com; 1:5) в течение ночи при 4 ° С,
анти-мышиные CD133 FITC-конъюгированные антитела (eBioscience Инк, 1:50) в течение ночи при 4 ° С, антимышиных стволовых клеток антигена 1 (Sca-1) (Ly-6A / E) PE-Cy5.5-конъюгированных антител (Caltag Laboratories,
Burlingame, CA, http://www.caltag.com, 1:100) в течение 30 минут при 4 ° С , анти-CD45 мышинные FITCконъюгированные антитела (Caltag лабораторий; 1:100) в течение 30 минут при 4 ° С, анти-мышинные CD11b PEконъюгированные антитела (eBioscience Инк, 1:100) в течение 30 минут при 4 ° C.
Количественный метод полимеразной цепной реакции
ДНК была извлечена из мышц реципиентов путем инкубации в 400 мкл TE / SDS буфера (100 мМ Трис, рН 8, 1 мМ
ЭДТА, 0,5% SDS) с добавилением протеиназы К (400 мкг, Roche Products Pty Ltd, Dee Why, Австралия ,
http://www.roche-australia.com) при 56 ° С в течение ночи при перемешивании. После обработки, 75 мкл NH4OAc и 1
мл абсолютного этанола перемешивали, затем центрифугировали в течение 20 минут. Супернатант удаляли, а
осадок ДНК промывают в 70% этаноле (1 мл) и центрифугируют в течение 10 минут. ДНК сушат на воздухе и вновь
растворяют в Milli-Q воды (100 мкл) и хранят при 4 ° C. Количественная обратная полимеразная цепная реакция
(ПЦР) проводится с использованием праймеров в следующей последовательности: Y хромосомы вперед (TGG AGA
GCC ACA AGC ТАА CCA), Y хромосоме обратно (TCC CAG CAT GAG AAA GAT TCT TC). Глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназа (GAPDH) была использована для количественной оценки общего количества ДНК,
присутствующих в образцах со следующей последовательностью: GAPDH вперед (GAA GGT GGT GAA GCA GGC
AT), GAPDH-обратно (GCA TCG AAG GTG GAA GAG ГТГ). Реакция объема (25 мкл) был сделан с 2 × QuantiTect
SYBR Green ® Master Mix (Qiagen, Hilden, Германия, http://www1.qiagen.com). Y-хромосома и GAPDH стандарт с
известной концентрацией ДНК были включены в анализ. Отрицательный контроль - женская ДНК и шаблон были
также включены. Реакции: денатурация (95 ° C в течение 15 минут), циклы (40 повторов, первый шаг при 95 ° C в
течение 20 секунд, второй шаг при 56 ° С в течение 20 секунд, а третьему шагу при 72 ° C в течение 30 секунд
приобретение SYBR зеленый сигнал), стабилизация (60 ° C в течение 1 минуты), расплавление (от 60 ° C до 95 ° C
5 секунд на первый шаг, 5 секунд на следующих шагах)
Результаты.
Селективное выживание и обогащение MGMT (P140K) преобразуют мышечные клетки с селекцией BCNU и O6BG
In Vitro
Мы сначала пытались определить может ли принудительная экспрессия MGMT (P140K) в C2C12 клетках и
миобластах человека обеспечивать защиту от BCNU в результате селективного обогащения преобразованных
клеток. Когда трансдуцированные и нетрансдуцированные клетки обрабатывали различными дозами BCNU (0 мкм,
50 мкм, 100 мкм, 200 мкм) и O6BG (40 мкм), анализ пролиферации клеток показал, что C2C12 (рис. 1А) и
человеческие первичные миобласты (рис. 1В), экспрессирующие MGMT (P140K) показали большую устойчивость к
BCNU и O6BG по сравнению с клетками дикого типа. Чтобы проверить селективное обогащение MGMT (P140K)экспрессирующих клеток, C2C12 культур, содержащих 0, 4, или 13% MGMT (P140K) преобразованных клеток на
фоне клетки дикого типа, клетки были обработаны четырьмя концентрация BCNU в течение 7 - дневного периода
(рис. 1в). Аналогично, человеческие первичные культуры миобластов содержащих 0 или 8% MGMT (P140K)трансдуцированных клеток обрабатывали тремя концентрациями BCNU за 13-дневный период (рис. 1D). FACS
анализ показал выборочное обогащение MGMT (P140K)-преобразованных клеток с течением времени в обеих
культурах, которые коррелируют с количеством MGMT (P140K)-преобразованных клеток изначально
присутствующих и дозами BCNU. Для обоих комплектов культур, более высокие дозы BCNU достигнули лучшего
выбора, чем при более низких дозах. Эти результаты также подтверждают, что EF-1α промоутер экспрессии MGMT
(P140K) активен, как в мышиных,так и в человеческих миогенных клетках.
Рисунок 1
На дифференцировку миобластов не влияет последующая ретровирусная трансдукция и BCNU/O6BG лечение
Чтобы определить можети ли ретровирусная трансдукция MGMT (P140K), а также BCNU/O6BG лечение
миобластов поставить под угрозу их способность к дифференциации, MGMT (P140K)-трансдуцированные C2C12
клетки обрабатывали BCNU/O6BG,что не помешало им дифференцироваться в мышечные трубки. Потенциал
дифференциации MGMT (P140K)-преобразованных клеток был сравненим с необработанным диким типом C2C12
клеток.Дифференцированные клетки были проанализированы для выявления экспрессии специфических белков
мышц тонкой нити, α-актинина-2 и саркомерного тропомиозина. Уровни экспрессии для α-актинина-2 и
саркомерного тропомиозина были сопоставимы между трансдуцированными ( BCNU/O6BG лечение) и диким типом
( BCNU/O6BG необработанные) клеток после начала дифференциации (рис. 2), что свидетельствует о скорости и
степени изменения дифференциации. Кроме того, иммунохимическое окрашивание α-актинина-2 показало
нормальное расположение саркомеров в MGMT (P140K) трансдуцированных клетках, обработанных BCNU/O6BG
(рис. 2В). BCNU/O6BG лечение дикого типа C2C12 культур отображает существенную гибель клеток и с
нарушением последующей дифференциации(данные не показаны).
Рисунок 2
Затруднения регенерации дикого типа мышц, обработанных BCNU + O6BG,в то время как MGMT (P140K)экспрессирующие мышцы сохранялись.
BCNU алкилирует ДНК внутри клетки независимо от состояния клеточного цикла, однако, результаты ДНК
алкилирования проявляются только тогда, когда клетка подвергается пролиферации. Скелетные мышцы находятся в
состоянии покоя в нормальных условиях, но становятся митотически активны во время регенерации. Чтобы
получить доказательства правильности принципа
того, что MGMT (P140K) может защитить от BCNU
алкилирования у
животных, мы использовали трансгенные линии мышей, у которых MGMT (P140K)
экспрессируется во всех типах клеток. Мы индуцировали регенерацию в EDL мышцах дикого типа и MGMT
(P140K) тг / тг мышей, введенный им инъекций нотексин агента (0,1 мкг) с и без BCNU + O6BG. После 10 дней
регенерации в случае отсутствия препарата , гистологические сечения дикого типа мышц показывали
регенерирующие мышечные волокна с внутренними ядерами, отличительной чертой нормальной регенерации
мышечных волокон (ср. рис. 3C, 3D с 3А, 3Б). Когда дикому типу EDL вводили нотексин и BCNU (0,2 мг, IM) +
O6BG (30 мг / кг б. Мас., IP), мышцы показали полное отсутствие регенерации мышечных волокон до 10 дней после
обработки (Рис. 3E , 3F). Эта неспособность к регенерации после лечения сохранялась через 90 дней (рис. 3G, 3H).
Это свидетельствует о том, что удаление спутниковых клеток BCNU/O6BG приводит к постоянной неспособности к
регенерации мышц. В противоположность этому, когда же процедура была применена к EDL мышцам MGMT
(P140K) трансгенных мышей, регенерирующие мышечные волокна явно присутствовали 10 дней после лечения
(рис. 3I, 3J). Хотя степень восстановления в среде обработанных MGMT (P140K) мышц трансгенных мышей была
уменьшена по сравнению с диким типом мышц, регенерирующим за тот же промежуток времени в отсутствие
препаратов (ср. рис. 3D с 3J), эти результаты подтверждают достаточное выражение MGMT (P140K) в клетках,
которые способствуют регенерации мышц
Рисунок 3
Иммунное обнаружение человеских MGMT выявило ряд MGMT (P140K)-экспрессирующих клеток в регенерации
мышц MGMT (P140K) трансгенных мышей (рис. 4C, 4D) по сравнению с необработанными мышцами (рис. 4А, 4В).
Поскольку экспрессия MGMT (P140K) трансгенов обусловлена EF-1α промоутером, который действует только в
митотически активных клетках, экспрессия MGMT (P140K) отсутствует в необработанных мышцах . После
BCNU/O6BG лечения, регенерирующие MGMT (P140K) трансгенные мышцы имеет значительно большее
количество MGMT-экспрессирующих клеток (рис. 4E, 4F) с указанием наувеличениепопуляции этих клеток при
выборе давления, оказываемого BCNU/O6BG лечением. Вестерн-блот анализ подтвердил увеличение количества
MGMT белка, присутствующего в MGMT (P140K) трансгенных EDL обработанных нотексином и BCNU/O6BG
(рис. 4G, переулок 7) по сравнению с обработанными только нотексином (рис. 4G, Lane 5). Необработанные MGMT
(P140K) трансгенные мышцы дикого типа, и мышцы, обработанныенотексином с или без BCNU/O6BG не содержат
обнаруживаемых уровней MGMT (рис. 4G, дорожки 2, 3, 4, 6).
Рисунок 4
Выделение и характеристика CD34 донорских клеток из регенирирующих скелетных мышц
CD34 антиген клеточной поверхности используется для выбора донорских клеток,
так как многие недавно идентифицированные мышечные стволовые клетки обычно
экспрессируют этот поверхностный антиген. Этот выбор стратегии позволил отобрать максимально возможное
число донорских клеток в естественных условиях с использованием одного маркера,сведя к минимуму время
необходимое для сортировки, при максимальной жизнеспособности клеток. Число клеток CD34,которые могут
быть изолированы из нормальных, неповрежденных мышц было ниже 1 × 105 клеток в мышцах TA (рис. 5).
Регинереирующая ТА взятаячерез 3 дня после инъекции нотексина , содержала на порядок больше клеток CD34,
примерно 11 × 105 клеток в мышцах TA (рис. 5). В рамках этого увеличения популяции клеток CD34, две различные
субпопуляции стали различимы после ночной культивации. Одна популяция - прилипшие клетки отображают
фибробластоподобную морфологию (рис. 5а), в то время как вторая популяции маленькие, круглые, преломляющие
свет клетки, неадгезивные (рис. 5б). Вестерн-блот анализ показал, высокую экспрессию MyoD, маркера миогенной
клетки (рис. 5). Кроме того, прилипшие клетки экспрессировали определяемые уровни миогенина, маркера
терминальной дифференцировки мышц (рис. 5).
Рисунок 5
Мы также характеризовали CD34 + популяцию с использованием FACS анализов. В ряде исследований сообщается,
что полученные стволовые и спутниковые предшественники мышечных клеток у мышей обычно выражают CD34 и
не экспрессируют CD45. Среди них субпопуляции спутниковых клеток предшественников не экспрессируют Sca-1,
в то время как другие, такие как мышечные стволовые клетки, мезоангиобласты все экспрессируют Sca-1. FACS
анализ показал, что CD45-ve/Sca-1-ve клетки составляли примерно 13% CD34 + VE клеток, выделенных из мышц
регенерирующим по сравнению с 31% в неповрежденных мышцах (Рис. 5E).Представление CD45-ve/Sca-1 +
субпопуляции было одинаково в неповрежденных и регенерирующих мышцах у 59 и 56%, соответственно (Рис.
5E).
Немышечные клетки, таких как эндотелиальные предшественники, моноциты и макрофаги привлекаются к месту
травмы в скелетных мышцах. Эти клетки играют важную роль не только в развитии активации и пролиферации
стволовых клеток, а также в удалении ткани мусора и участии в реваскуляризации. Для оценки представления таких
опорных клеток в CD34 + популяции FACS анализ проводился для количественной оценки доли CD133 + е (маркер
эндотелиальных клеток-предшественников), CXCR4 + е (рецепторы для цитокинов стромальные, полученные
фактор-1 [SDF -1]) и CD11b + VE (маркер для моноцитов). Каждая из этих трех подгрупп составила очень
небольшую часть CD34 + VE клеток, выделенных из неповрежденных мышц примерно на 3% -5% (Рис. 5E). Тем не
менее, при мышечной регенерации процент значительно увеличится в CD34 +
популяции: 30% CD133 + , 24% CXCR4 + , 66% CD11b + клеток (Рис. 5E). Наличие
этих опорных клеток в значительных количествах в CD34 + популяции клеток из регенерирующих мышц может
оказаться полезным для распространения донорских стволовых клеток после трансплантации.
Увеличенное выживание CD34 + MGMT (P140K) донорских клеток и образование De Novo мышечных волокон
Чтобы проверить, может ли защита и селективное обогащение MGMT (P140K)-экспрессирующих клеток
происходить в естественных условиях после трансплантации, доноры CD34 + клеток из мышцы MGMT (P140K) тг
/ тг или C57BL/6JArc мышей дикого типа пересаживают в EDL мышцы реципиента дикого типа C57BL/6JArc
мышей. Донорские клетки вводятся в мышцы реципиента вместе с нотексином (0,2 мкг), чтобы вызвать
дегенерацию здоровых мышц. Мыши реципиенты были разделены на три группы с пятью мышами или более в
каждой группе: Группа А (дикий тип клеток донора только), Группа B (дикий тип донорских клеток с BCNU +
O6BG), Группа C (MGMT [P140K] тг / тг клеток донора с BCNU + O6BG).
Мышцы реципиента были собраны через 7 дней после трансплантации, а также процент мужской ДНК был
определен с использованием количественной ПЦР. В группе А (n = 5), небольшая часть от общего числа ДНК
(0,39% ± 0,05% SD) был донорского происхождения (рис. 6, группа А). Эта группа представляет собой обычный
протокол трансплантации донорских клеток, которые пересаживают в мышцу получателя без какого-либо отбора. В
группе В (n = 8), высокая доля ДНК донора (2,1% ± 0,6% SD), возможно, отражает цитотоксический эффект
BCNU/O6BG лечения на мышцы регенерирующей эндогенной популяции стволовых клеток (рис. 6, Группа B). В
этой группе только донорские клетки, которые вышли из клеточного цикла во время трансплантации выжили бы,
так как пролиферирующие клетки дикого типа были также подвержены цитотоксическому эффекту BCNU/O6BG
во время пересадки. Мышцы реципиентов из группы С (п = 10) содержат самый высокий процент (6,4% ± 1,7% SD)
донорской ДНК (рис. 6, группа C), что свидетельствует о защитном эффекте MGMT (P140K) против
цитотоксических эффектов BCNU / O6BG,и привело к селективному выживанию и обогащению донорских клеток
Рисунок 6
Когда мышцы из группы B (n = 5) и С (п = 5) были собраны через 14 дней после трансплантации, мышцы из двух
групп показали замечательную разницу в размерах (ср. рис. 7А и 7D). Гистологическое исследование показало
отсутствие нормальной реакции восстановления в мышцах группы B (дикий тип доноров), большинство ткани
занимают мононуклеарные клетки (рис. 7б, 7в). Это говорит о том, что повышение количества клеток дикого типа
донора в BCNU/O6BG-обработанных мышцах не проявляется как повышение регенерации мышц. В отличие от
группы C мышц с донорскими клетками MGMT (P140K) трансгенных мышей, показавших нормальную реакцию
регенерации, с обильными мышечными волокнами, содержащими централизованно ориентированные ядра, что
свидетельствует о регенерации волокон (рис. 7E, 7F).
Рисунок 7
Дискуссия.
MGMT (P140K)-опосредованное обогащение клеток доноров после трансплантации стволовых клеток в скелетные
мышцы
Наши результаты дают доказательство правильности концепции того, что MGMT (P140K)-опосредованная
BCNU/O6BG селективная стратегия обогащения может быть успешно применена в соматических стволовых
клетках скелетных мышц. Эта стратегия была разработана для прижизненного обогащения гемопоэтических
стволовых клеток с доказанной эффективностью. Негемопоэтическое применение стратегии на сегодняшний день
показало, что клетки костного мозга экспрессирующие MGMT (P140K) можно прививать в легких. Здесь мы
покажем, успешное приживление MGMT (P140K) экспрессирующих CD34 + клеток после трансплантации
скелетных мышцах, обрабатанных алкилирующим агентом. Насаждение популяции клеток донора может включать
в себя клетки спутника, а также другие стволовые клетки, экспресирующие антиген CD34 на момент изоляции.
Кроме того, другие немышечные типы клеток в пределах CD34 + популяции клеток-доноров могли бы обеспечить
косвенную поддержку приживления донорских мышечных стволовых клеток и образование волокон.
В предыдущих исследованиях с участием трансплантации стволовых клеток, выживание клеток донора в
трансплантации хозяину было одной из основных проблем. Выживание и приживление MGMT (P140K)экспрессирующих донорских клеток, показаное в этом исследовании, подтверждает важность восприимчивости
хозяина в начале выживания и последующего распространения донорских стволовых клеток. Концепция
кондиционирования принимающей ниши привела к использованию нелетальных доз облучения для абляции
деятельности клеток-хозяина. Тем не менее существуют два основных аргумента против такого метода:в том числе
вопрос безопасности применения высоких доз облучения для достижения значимого кондиционирования ниши
хозяина и недискриминационный характер облучения, в результате чего клетки донора в равной степени
подвержены повреждениям, если последующие дозы облучения применяются. Эта стратегия может обеспечить
эффективную терапию для лечения заболеваний, при которых конкретные мышцы страдают, таких как окулоглоточная мышечная дистрофия, в сочетании с вирусной трансдукцией донорских стволовых клеток для
исправления генетических мутаций. Кроме того, ограниченная локальная доставка алкилирующих агентов,
используемыех в этом исследовании, подчеркивает безопасность этого способа доставки. Это обнадеживает,
учитывая, что клеточная терапия для замены неблагополучных взрослых стволовых клеток вследствие старения и в
результате различных генетических / дегенеративных заболеваний в настоящее время рассматривается во многих
различных типах тканей, включая легкие расстройства, хронические травмы печени, желудочно-кишечные
расстройства и I и II тип сахарного диабета. Наши данные подтверждают возможность применения MGMTопосредованной стратегии обогощения клеток донора в других типах тканей и органов, где клеточная терапия
существует как возможный вариант лечения.
Индукция эндогенной регенерации мышц после трансплантации донорских клеток CD34 + экспрессирующих
MGMT (P140K)
Неожиданное открытие, что эндогенные клетки вносят значительный вклад в регенерацию BCNU/O6BGобработанных мышц получателя после трансплантации MGMT (P140K)-экспрессирующих клеток донора возникает
вопрос, какие факторы и / или типы клеток маршалируются MGMT (P140K)экспрессирующими клетками и
почему? В отсутствие пересаженных MGMT (P140K)-экспрессирующих клеток, эта мышца не в состоянии
самостоятельно регенерировать после травмы и медикаментозного лечения (за этим последовало до 90 дней, на рис.
3G, 3H). Мы полагаем, что фактор (ы), которые выделяется при образовании донорнопроизводных мышечных волокон, привлекают клетки, которые способны к миогенной
дифференциации. Одним из таких кандидатов является α-хемокин (SDF-1), хемоаттрактант для клеток с G-белками
рецептора CXCR4. Это хорошо установлено, что SDF-1 освобождается из регенирирующих мышц, но что более
важно, что недифференцированные спутниковые клетки мышц экспрессируют CXCR4 и реакция хемоаттрактанта
обеспечивается наличием SDF-1 через фосфорилирование p42 / 44 митоген-активированной протеинкиназы
(МАРК) и AKT серин-треонин киназы.
Поэтому вполне возможно, что клетки-сателлиты, проживающих в мышцах, прилегающих к EDL получают MGMT
(P140K) донорских клеток мигрируют в эту мышцу и способствуют регенерации в ответ на освобождение SDF-1 из
волокон, образованных из донорских клеток. Тем не менее, количество этих клеток, проживающих в соседних
мышцах будет сокращено, потому что при местных внутривенных инъекциях с последующей 2-х минутной
блокадой кровотока в проксимальном отделе задних конечностей были бы подвержены все соседние группы мышц
(и их резидентные клетки спутники) в задней конечности последствиям BCNU. После алкилирования клетки не
смогли бы пройти деление, тем самым уменьшая вклад сателлитных клеток из соседних мышц.
Документально подтверждено, что одно мышечное волокно (содержит в среднем семь прикрепленных клеток
спутников) может генерировать более 100 новых мышечных волокон. Более того, недавние исследования показали,
что одной стволовой клеткой мышцы пересаженной таким же образом удалось привести к самообновлению
последовательных волн после последовательной травмы мышц. Поэтому вполне возможно, в этом исследовании,
что одна или небольшое число клеток-сателлитов уреципиента и / или соседних мышцах были избавлены от
алкилирования, ответили на сигналы от пересаженных клеток донора и способствовали значительной эндогенной
регенерации.
Другая возможность состоит в том, что клетки способствуют регенерации эндогенных мышц , может исходить из
клеток, происходящих из удаленных источников, таких как костный мозг.Вклад клеток костного мозга в
регенерацию мышечных клеток был описан в ряде работ. Было не ясно, до недавнего времени, является ли
включение клеток костного мозга результатом случайного слияния воспалительных клеток в мышцах и
регенерирующих клеток , или некоторые клетки в костном мозге, обладают способностью дифференцироваться в
миогенную линию. В недавнем исследовании, CD45 клетки костного мозга смогли привести к CD45 клеткам,
способным к миогенной дифференциации. Эти клетки способны образовывать волокна де-ново в мышце
реципиента .
Периферическая кровь уже давно рассматривается как "шоссе" для лимфоидных клеток памяти и гемопоэтических
стволовых клеток. С доказательством того, что циркулирующие клетки в периферической крови могут внести свой
вклад в мышцы была выдвинута гипотеза, что стволовые клетки могут находиться в периферической крови.
Недавно мезенхимальные стволовые клетки (или мультипотентных стромальных клеток) были определены как
вклад в восстановление ряда мезенхимальных тканей, включая кости, мышцы, хрящи, сухожилия, и жировую ткань,
с замечательной способностью к миграции в места травмы.
Потенциал для остаточных неалкилированных эндогенных стволовых клеток в соседних мышцах и / или
мобилизованных стволовых клеток в периферической крови, чтобы способствовать регенерации в ответ на
пересаженные MGMT (P140K)-экспрессирующие клетки, может работать против стратегии селективного заселения
мышц. Тем не менее, потенциал эндогенных стволовых клеток может быть преодолен и стволовые клетки
периферической крови могут быть использованы в качестве еще одного источника MGMT (P140K). Характер
MGMT-опосредованного выбора стратегии позволяет дальнейшее обогащение стволовых клеток донора с
применением последующих инъекций алкилирующих агентов. С помощью этой стратегии, Davies и соавт. удалось
добиться 75% -100% приживления донорских клеток после трансплантации MGMT (P140K) донорских клеток в
сочетании с повторным лечением алкилирующими агентами и O6BG. Аналогичное исследование будет
проводиться в мышцах, чтобы определить вклад эндогенных клеток,который может быть подавлен последующим
лечением BCNU и O6BG.
Ссылки
1Bank A. Hematopoietic stem cell gene therapy: selecting only the best. J Clin Invest 2003; 112: 1478–1480.
PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 11
2Gerull S, Beard BC, Peterson LJ et al. In vivo selection and chemoprotection after drug resistance gene therapy in a
nonmyeloablative allogeneic transplantation setting in dogs. Hum Gene Ther 2007; 18: 451–456.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 5
3Persons DA, Allay ER, Sawai N et al. Successful treatment of murine beta-thalassemia using in vivo selection of genetically
modified, drug-resistant hematopoietic stem cells. Blood 2003; 102: 506–513.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 61
4Reese JS, Roth JC, Gerson SL. Bone marrow-derived cells exhibiting lung epithelial cell characteristics are enriched in vivo
using methylguanine DNA methyltransferase-mediated drug resistance. Stem Cells 2008; 26: 675–681.
Direct Link:
AbstractFull Article (HTML)PDF(1413K)References
5Podda S, Ward M, Himelstein A et al. Transfer and expression of the human multiple-drug resistance gene into live mice.
Proc Natl Acad Sci U S A 1992; 89: 9676–9680.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 206,ADS
6Sorrentino BP, Brandt SJ, Bodine D et al. Selection of drug-resistant bone-marrow cells in vivo after retroviral transfer of
human Mdr1. Science 1992; 257: 99–103.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 446,ADS
7Abonour R, Williams DA, Einhorn L et al. Efficient retrovirus-mediated transfer of the multidrug resistance 1 gene into
autologous human long-term repopulating hematopoietic stem cells. Nat Med 2000; 6: 652–658.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 198
8Allay JA, Persons DA, Galipeau J et al. In vivo selection of retrovirally transduced hematopoietic stem cells. Nat Med 1998;
4: 1136–1143.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 161
9Cowan KH, Moscow JA, Huang H et al. Paclitaxel chemotherapy after autologous stem-cell transplantation and
engraftment of hematopoietic cells transduced with a retrovirus containing the multidrug resistance complementary DNA
(MDR1) in metastatic breast cancer patients. Clin Cancer Res 1999; 5: 1619–1628.
PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 91
10Hibino H, Tani K, Ikebuchi K et al. The common marmoset as a target preclinical primate model for cytokine and gene
therapy studies. Blood 1999; 93: 2839–2848.
PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 25
11Licht T, Haskins M, Henthorn P et al. Drug selection with paclitaxel restores expression of linked IL-2 receptor gammachain and multidrug resistance (MDR1) transgenes in canine bone marrow. Proc Natl Acad Sci U S A 2002; 99: 3123–3128.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 23,ADS
12Moscow JA, Huang H, Carter C et al. Engraftment of MDR1 and NeoR gene-transduced hematopoietic cells after breast
cancer chemotherapy. Blood 1999; 94: 52–61.
PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 101
13Persons DA, Allay JA, Bonifacino A et al. Transient in vivo selection of transduced peripheral blood cells using antifolate
drug selection in rhesus macaques that received transplants with hematopoietic stem cells expressing dihydrofolate
reductase vectors. Blood 2004; 103: 796–803.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 23
14Bowman JE, Reese JS, Lingas KT et al. Myeloablation is not required to select and maintain expression of the drugresistance gene, mutant MGMT, in primary and secondary recipients. Mol Ther 2003; 8: 42–50.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 22
15Jansen M, Sorg UR, Ragg S et al. Hematoprotection and enrichment of transduced cells in vivo after gene transfer of
MGMT(P140K) into hematopoietic stem cells. Cancer Gene Ther 2002; 9: 737–746.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 31
16Neff T, Horn PA, Peterson LJ et al. Methylguanine methyltransferase-mediated in vivo selection and chemoprotection of
allogeneic stem cells in a large-animal model. J Clin Invest 2003; 112: 1581–1588.
PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 54
17Neff T, Beard BC, Peterson LJ et al. Polyclonal chemoprotection against temozolomide in a large-animal model of drug
resistance gene therapy. Blood 2005; 105: 997–1002.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 37
18Ragg S, Xu-Welliver M, Bailey J et al. Direct reversal of DNA damage by mutant methyltransferase protein protects mice
against dose-intensified chemotherapy and leads to in vivo selection of hematopoietic stem cells. Cancer Res 2000; 60:
5187–5195.
PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 83
19Sawai N, Zhou S, Vanin EF et al. Protection and in vivo selection of hematopoietic stem cells using temozolomide, O-6benzylguanine, And An alkyltransferase-expressing Retroviral Vector. Mol Ther 2001; 3: 78–87.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 77
20Gerson SL. Selection without harm: Drug resistance gene therapy hits the big time. Blood 2005; 105: 914–914.
CrossRef,CAS,Web of Science® Times Cited: 1
21Pegg AE. Mammalian O-6-Alkylguanine-DNA alkyltransferase—Regulation and importance in response to alkylating
carcinogenic and therapeutic agents. Cancer Res 1990; 50: 6119–6129.
PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 685
22Gerson SL. MGMT—Its role in cancer aetiology and cancer therapeutics. Nat Rev CA 2004; 4: 296–307.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 195
23Xu-Welliver M, Kanugula S, Pegg AE. Isolation of human O-6-alkylguanine-DNA alkyltransferase mutants highly resistant
to inactivation by O-6-benzylguanine. Cancer Res 1998; 58: 1936–1945.
PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 70
24Davis BM, Koc ON, Gerson SL. Limiting numbers of G156A O-6-methylguanine-DNA methyltransferase-transduced
marrow progenitors repopulate nonmyeloablated mice after drug selection. Blood 2000; 95: 3078–3084.
PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 92
25Cossu G, Sampaolesi M. New therapies for Duchenne muscular dystrophy: Challenges, prospects and clinical trials.
Trends Mol Med 2007; 13: 520–526.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 20
26Morgan JE, Coulton GR, Partridge TA. Muscle precursor cells invade and repopulate freeze-killed muscles. J Muscle Res
Cell Motil 1987; 8: 386–396.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 63
27Partridge T. Myoblast transplantation. Neuromuscul Disord 2002; 12: S3–S6.
CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 24
28Partridge TA, Morgan JE, Coulton GR et al. Conversion of Mdx myofibers from dystrophin-negative to dystrophin-positive
by injection of normal myoblasts. Nature 1989; 337: 176–179.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 501,ADS
29Huard J, Bouchard JP, Roy R et al. Human Myoblast transplantation—Preliminary-results of 4 cases. Muscle Nerve 1992;
15: 550–560.
Direct Link:
AbstractPDF(2190K)References
30Karpati G, Ajdukovic D, Arnold D et al. Myoblast transfer in duchenne muscular-dystrophy. Ann Neurol 1993; 34: 8–17.
Direct Link:
AbstractPDF(1006K)References
31Mendell JR, Kissel JT, Amato AA et al. Myoblast transfer in the treatment of duchennes muscular-dystrophy. N Engl J Med
1995; 333: 832–838.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 217
32Miller RG, Sharma KR, Pavlath GK et al. Myoblast implantation in Duchenne muscular dystrophy: The San Francisco
study. Muscle Nerve 1997; 20: 469–478.
Direct Link:
AbstractPDF(300K)References
33Tremblay JP, Malouin F, Roy R et al. Results of a triple blind clinical-study of myoblast transplantations without
immunosuppressive treatment in young boys with Duchenne muscular-dystrophy. Cell Transplant 1993; 2: 99–112.
PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 188
34Fan Y, Maley M, Beilharz M et al. Rapid death of injected myoblasts in myoblast transfer therapy. Muscle Nerve 1996; 19:
853–860.
Direct Link:
AbstractPDF(837K)References
35Skuk D, Roy B, Goulet M et al. Successful myoblast transplantation in primates depends on appropriate cell delivery and
induction of regeneration in the host muscle. Exp Neurol 1999; 155: 22–30.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 40
36Skuk D, Goulet M, Roy B et al. Efficacy of myoblast transplantation in nonhuman primates following simple intramuscular
cell injections: Toward defining strategies applicable to humans. Exp Neurol 2002; 175: 112–126.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 40
37Blau HM, Webster C. Isolation, characterization of human-muscle cells. Proc Natl Acad Sci U S A 1981; 78: 5623–5627.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 277,ADS
38Kramer BA, Lemckert FA, Alexander IE et al. Characterisation of a P140K mutant O6-methylguanine-DNAmethyltransferase (MGMT)-expressing transgenic mouse line with drug-selectable bone marrow. J Gene Med 2006; 8:
1071–1085.
Direct Link:
AbstractFull Article (HTML)PDF(631K)References
39Montarras D, Morgan J, Collins C et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science 2005;
309: 2064–2067.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 123,ADS
40Hagstrom JE, Hegge J, Zhang G et al. A facile nonviral method for delivering genes and siRNAs to skeletal muscle of
mammalian limbs. Mol Ther 2004; 10: 386–398.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 63
41Vlahovich N, Schevzov G, Nair-Shaliker V et al. Tropomyosin 4 defines novel filaments in skeletal muscle associated with
muscle remodelling/regeneration in normal and diseased muscle. Cell Motil Cytoskeleton 2008; 65: 73–85.
Direct Link:
AbstractPDF(839K)References
42Muskiewicz KR, Frank NY, Flint AF et al. Myogenic potential of muscle side and main population cells after intravenous
injection into sub-lethally irradiated mdx mice. J Histochem Cytochem 2005; 53: 861–873.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 11
43Schevzov G, Vrhovski B, Bryce NS et al. Tissue-specific tropomyosin isoform composition. J Histochem Cytochem 2005;
53: 557–570.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 26
44Le Fevre AC, Boitier E, Marchandeau JP et al. Characterization of DNA reactive and non-DNA reactive anticancer drugs by
gene expression profiling. Mutat Res 2007; 619: 16–29.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 7
45Jefferies HBJ, Thomas G, Thomas G. Elongation factor-1-alpha messenger-RNA is selectively translated following
mitogenic stimulation. J Biol Chem 1994; 269: 4367–4372.
PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 94
46Peault B, Rudnicki M, Torrente Y et al. Stem and progenitor cells in skeletal muscle development, maintenance, and
therapy. Mol Ther 2007; 15: 867–877.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 78
47Qu-Petersen ZQ, Deasy B, Jankowski R et al. Identification of a novel population of muscle stem cells in mice: Potential
for muscle regeneration. J Cell Biol 2002; 157: 851–864.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 276
48Sampaolesi M, Torrente Y, Innocenzi A et al. Cell therapy of alpha-sarcoglycan null dystrophic mice through intra-arterial
delivery of mesoangioblasts. Science 2003; 301: 487–492.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 179,ADS
49Gussoni E, Soneoka Y, Strickland CD et al. Dystrophin expression in the mdx mouse restored by stem cell transplantation.
Nature 1999; 401: 390–394.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 1041,ADS
50Tidball JG. Inflammatory processes in muscle injury and repair. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2005; 288: R345–
R353.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 111
51Horn PA, Morris JC, Neff T et al. Stem cell gene transfer-efficacy and safety in large animal studies. Mol Ther 2004; 10:
417–431.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 12
52Neff T, Beard BC, Kiem HP. Survival of the fittest: In vivo selection and stem cell gene therapy. Blood 2006; 107: 1751–
1760.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 15
53Kinoshita I, Vilquin JT, Guerette B et al. Very efficient myoblast allotransplantation in mice under Fk506
immunosuppression. Muscle Nerve 1994; 17: 1407–1415.
Direct Link:
AbstractPDF(1071K)References
54Wernig A, Zweyer M, Irintchev A. Function of skeletal muscle tissue formed after myoblast transplantation into irradiated
mouse muscles. J Physiol (Lond) 2000; 522: 333–345.
Direct Link:
AbstractFull Article (HTML)PDF(2082K)References
55Mimeault M, Hauke R, Batra SK. Stem cells: A revolution in therapeutics—Recent advances in stem cell biology and their
therapeutic applications in regenerative medicine and cancer therapies. Clin Pharmacol Ther 2007; 82: 252–264.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 45
56Pituch-Noworolska A, Majka M, Janowska-Wieczorek A et al. Circulating CXCR4-positive stem/progenitor cells compete
for SDF-1-positive niches in bone marrow, muscle and neural tissues: An alternative hypothesis to stem cell plasticity. Folia
Histochem Cytobiol 2003; 41: 13–21.
PubMed,Web of Science® Times Cited: 37
57Ratajczak M, Majka M, Kucia M et al. Expression of functional CXCR4 by muscle satellite cells and secretion of SDF-1 by
muscle-derived fibroblasts is associated with the presence of muscle progenitors in bone marrow and hematopoietic
progenitors in muscles: A new perspective on stem cell plasticity. Exp Hematol 2003; 31: 77–77.
Web of Science® Times Cited: 1
58Collins CA, Olsen I, Zammit PS et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult
muscle satellite cell niche. Cell 2005; 122: 289–301.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 193
59Sacco A, Doyonnas R, Kraft P et al. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature 2008;
456: 502–506.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 20,ADS
60Ferrari G, Cusella-De Angelis G, Coletta M et al. Muscle regeneration by bone marrow derived myogenic progenitors.
Science 1998; 279: 1528–1530.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 1430,ADS
61LaBarge MA, Blau HM. Biological progression from adult bone marrow to mononucleate muscle stem cell to
multinucleate muscle fiber in response to injury. Cell 2002; 111: 589–601.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 367
62Luth ES, Jun SJ, Wessen MK et al. Bone marrow side population cells are enriched for progenitors capable of myogenic
differentiation. J Cell Sci 2008; 121: 1426–1434.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 3
63Blau HM, Brazelton TR, Weimann JM. The evolving concept of a stem cell: Entity or function? Cell 2001; 105: 829–841.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 492
64Lagasse E, Shizuru JA, Uchida N et al. Toward regenerative medicine. Immunity 2001; 14: 425–436.
CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 85
65Chamberlain G, Fox J, Ashton B et al. Concise review: Mesenchymal stem cells: Their phenotype, differentiation capacity,
immunological features, and potential for homing. Stem Cells 2007; 25: 2739–2749.
Direct Link:
AbstractFull Article (HTML)PDF(369K)References
Переведено проектом МОЙМИО: www.mymio.org
Оригинал статьи: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/stem.28/abstract;j