Введение. - Институт фундаментальной биологии и

Федеральное государственное автономное
образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
Институт фундаментальной биологии и
биотехнологии
Биофизики
кафедра
РЕФЕРАТ
Флуоресценция НАДН
Студент
Б.С. Толоконников
Красноярск 2011
Содержание
Введение. ........................................................................................................................................... 3
НАДН................................................................................................................................................... 4
Природа НАДН............................................................................................................................... 4
Механизм аутофлуоресценции флуорофоров ........................................................................... 4
Методы и материалы исследования ............................................................................................... 6
Материалы ..................................................................................................................................... 6
Объекты исследования ................................................................................................................. 6
Подготовка эксперимента ............................................................................................................ 6
Спектроскопия ............................................................................................................................... 6
Другое применение НАДН и НАДФ ................................................................................................. 7
Результаты ......................................................................................................................................... 8
Список литературы ............................................................................................................................ 9
Введение.
Флуоресцентный анализ в оптической биопсии базируется на собственной флуоресценции
клеток и тканей при их облучении ультрафиолетовым (или видимым) светом, которая реагирует
на изменения функционального состояния; зачастую другие методы не улавливают структурных
или функциональных изменений в тканях, в то время как интенсивность излучения можно
зарегистрировать. Это даёт возможность применять флуоресцентную спектроскопию для
диагностики состояния биологических тканей. В процессе биохимических реакций в ткани (клетке)
меняется относительное содержание флуорофоров, характеризующихся собственной
флуоресценцией. Наиболее важны следующие тканевые флуорофоры: триптофан; коллаген и
эластин; восстановленный никотинамидадениндинуклеотид (НАДН) и его фосфат (НАДФН);
флавины и флавопротеины; β-каротин; порфирины. Мы ограничим рассмотрение лишь
флуорофором НАДН.1
НАДН
Природа НАДН
НАДН – сильный флуорофор в ткани, пиридиннуклеотид. Он присутствует в цитоплазме и
митохондриях клеток, выполняя функцию кофермента в окислительных и синтетических
процессах. Обладает характерными спектрами поглощения, включающими две полосы в
ультрафиолетовой области (при =260 нм и =340 нм), а также типичным спектром собственной
флуоресценции с максимумом на интервале от 455 до 480 нм.
Рис. 1. Спектры поглощения (а) и люминесценции (б) НАД.
1 – окисленная форма (НАД+), 2 – восстановленная (НАДН).
Установлено, что при переходе НАДН в НАД+ (в процессе окисления) теряется одна из полос
поглощения (при =340 нм) и утратой способности люминесцировать. При связывании НАД+
апоферментом интенсивность голубого свечения нарастает, причём максимум этой собственной
флуоресценции приходится на видимую часть электромагнитного спектра =440 нм.
Механизм аутофлуоресценции флуорофоров
Спектр аутофлуоресценции ткани – наложения подобных спектров большого количества
тканевых флуорофоров, имеющих близкорасположенные максимумы. В этих условиях
определение концентрации того или иного биохимического компонента по интенсивности
флуоресценции на длинах волн, соответствующих максимумам флуоресценции чистых веществ,
становится непростой задачей.
К сожалению, при анализе возникают серьёзные искажения спектров. Первой причиной
является совпадение пиков люминесценции тканевых флуорофоров с максимума поглощения
гемопротеидов (гемоглобин, миоглобин, др.) Другой причиной может быть налииче у ряда
органов серозных оболочек и соединительно-тканных капсул, состоящих, в основном, из
коллагена и эластина, биохимические процессы в которых необязательно совпадают с таковыми в
органах, которые они покрывают.
Также стоит учитывать длительность проведения флуоресцентного анализа – в течение
слишком длительного времени может произойти фотовыгорание флуорофора. Скорость
выгорания зависит от интенсивности лазерного излучения, падающего на ткань, а также от
метаболической активности в клетках ткани.
Ишемия ткани приводит к изменению соотношения некоторых деривативов гемоглобина и
миоглобина, имеющих различные спектры поглощения, что искажает данные по спектрам
флуоресценции, но позволяет косвенно оценивать степень ишемии ткани.
Несмотря на вышеозначенные проблемы, метод флуоресцентного анализа находит всё
большее распространение в клинической диагностике. Основной решаемой задачей метода
флуоресцентной оптической биопсии является получение флуоресцентных "автографов"
различных тканей и органов в нормальных условиях и при отклонениях; а также получение
критериев различия в спектрах люминесценции.1
Методы и материалы исследования
Материалы
В опыте на миоцитах сердечных тканей были использованы следующие материалы:
1.
2.
3.
4.
Коллагеназа второго типа
Альбумин коровьей сыворотки
Дыхательный разобщающий агент карбонилцианид-трифлуорометоксифенилгидразон
Флуоресцирующие краски (типы 5 и 6) карбоксифлюоросцеин диацетат,
янтарномидиловый сложный эфир, 2-(4-диметиламиностирил)-Н-метилпиридин йодид.2
Объекты исследования
Объектами исследования стали миоциты сердечных тканей взрослых мышей Спрега-Доули.
Мышей проанестезировали натрий пентаорбиталом, затем в их кровь был введён гепарин натрий,
препятствующий свёртыванию крови. После этого сердца были извлечены из организмов, а затем
– промыты безкальциевой жидкостью с целью удаления крови из сосудов. Ткани промытого
сердца были вырезаны, мелко нарезаны, отцентрифугированы в различных растворах. В
результате были получены миоциты сердечных тканей в чистом виде.2
Подготовка эксперимента
На миоциты, покрытые слоем бегущей жидкости, был направлен реверсивный микроскоп,
дающий увеличение в 63 раза. Изменения флуоресценции отражались на видеозаписи, снятой с
отражения от дихроичного (двухцветного) зеркала.
Спектроскопия
Камера перемещалась над исследуемым образцом, совершая анализ спектра за 33
миллисекунды. Для улучшения качества опыта каждый анализ был проведён десять раз.
Совершив движение горизонтально вдоль 500 пикселей камеры, камера совершала такой же
анализ на следующей строке. Получившиеся данные подавались на видеоконтроллер
компьютера, и, как результат, образовывали выборку. После этого выборка подверглась
корректировке – для каждой точки была взята сумма значений в данной точке и значений вокруг
этой точки. Это позволило исключить помехи, вызванные флуоресценцией подложки,
обтекающей жидкости и др. Получившаяся картинка, имеющая реальные размеры 0,2 мкм х0,2
мкм (256 оттенков серого), была выведена на экран.
Другое применение НАДН и НАДФ
Также молекулы НАДН и НАДФ можно использовать в исследовании наличия в клетке
молекул апорепрессора (в приведённом опыте рассматривался апорепрессор карбоксил-радикал
связывающий протеин (КрСП)).3
С позиции того, что и молекулы НАДН, и молекулы фосфата НАДН (НАДФ) действуют
примерно одинаково на данный апорепрессор, в эксперименте рассматривалось суммарное
влияние НАДН и НАДФ на апорепрессор.
При связывании молекул НАДН (НАДФ) с апорепрессором, резко увеличивается время
флуоресценции (до 4 раз), что также служит своеобразным маркером изменения процессов в
клетке.
Результаты
Полученные результаты свечения позволили утверждать, какие клетки сохранили
жизнеспособность, а какие – нет. Обычные палочковидные миоциты имеют высокую
интенсивность флуоресценции, а нежизнеспособные миоциты круглой формы резко проигрывают
в интенсивности (до 10% от интенсивности палочковидных миоцитов). Максимум
аутофлуоресценции совпадает по значению интенсивности с максимумом флуоресценции
флуоресцирующего раствора.
Последующие добавления в раствор с миоцитами сторонних веществ (цианида или FCCP –
митохондриального разобщающего агента) – резко изменяло интенсивность свечения
(увеличивало или уменьшало, соответственно), что являлось косвенным признаком изменения
работы клеток.
Следовательно, отсутствие светимости клеток может указывать на недостаточное
снабжение клетки жизненно важным кислородом.
В итоге – флуоресценция является признаком, по которому можно определить состояние
молекул НАДН в клетке, и, как следствие, признаком кислородной недостаточности клетки, и,
соответственно, ткани2, а также признаком наличия и работоспособности апорепрессоров в
клетке.3
Список литературы
1. Лазерная флуоресцентная диагностика в оптической биопсии. В.В., Салмин.
Красноярск : Красноярский Государственный Университет, 2004 r.
2. Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac
myocytes. John Eng, Ronald M. Lynch, Robert S. Balaban. April 1989 r., Biophysical Journal, Т. 55, стр.
621-630.
3. Regulation of Corepressor Function by Nuclear NADH. Qinghong Zhang, David W. Piston,
Richard H. Goodman. 8 March 2002 r., SCEINCE, Т. 295, стр. 1895-1897.
1
Лазерная флуоресцентная диагностика в оптической биопсии. В.В., Салмин. Красноярск :
Красноярский Государственный Университет, 2004 г.
2
Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes.
John Eng, Ronald M. Lynch, Robert S. Balaban. April 1989 r., Biophysical Journal, Т. 55, стр. 621-630.
3
Regulation of Corepressor Function by Nuclear NADH. Qinghong Zhang, David W. Piston, Richard H.
Goodman. 8 March 2002 r., SCEINCE, Т. 295, стр. 1895-1897.