Автореферат Гулина Д.А. - Институт биохимической физики им

Дата размещения:19 – 10 – 2009
ОБЪЯВЛЕНИЕ О ЗАЩИТЕ КАНДИДАТСКОЙ ДИССЕРТАЦИИ
ГУЛИН ДМИТРИЙ АНДРЕЕВИЧ
КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ И МЕХАНИЗМ РЕГУЛЯЦИИ
АКТИВНОСТИ ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ РАЗЛИЧНЫМИ
ЭФФЕКТОРАМИ
03.00.02 – биофизика.
Химические науки
Диссертационный совет Д 002.039.01
Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики
им. Н.М. Эмануэля РАН
119334 г. Москва, ул. Косыгина, д. 4
Тел. +7 (495) 939 74 00
e-mail:ibcp@ sky.chph.ras.ru
Предполагаемая дата защиты: 25 ноября 2009 г.
Автореферат Гулина Д.А.
На правах рукописи
ГУЛИН
ДМИТРИЙ АНДРЕЕВИЧ
КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ И МЕХАНИЗМ
РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ
РАЗЛИЧНЫМИ ЭФФЕКТОРАМИ
03.00.02 - Биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
кандидата химических наук
МОСКВА – 2009
2
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимической
физики им. Н.М. Эмануэля РАН и на кафедре химической энзимологии Химического
факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова
Научные руководители:
доктор химических наук, профессор,
член-корреспондент РАН,
Варфоломеев Сергей Дмитриевич
кандидат химических наук
Айсина Роза Бакировна
Официальные оппоненты:
доктор химических наук, профессор
Чухрай Елена Семеновна
доктор биологических наук, профессор
Максименко Александр Васильевич
Ведущая организация:
Учреждение Российской академии наук
Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН,
Москва
Защита состоится «25» ноября 2009 года в 11 часов на заседании Диссертационного
совета Д 002.039.01 при Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН по
адресу: 119334, Москва, ул. Косыгина, д. 4.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии
наук Института химической физики им. Н.Н. Семенова РАН
Автореферат разослан «____» октября 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
кандидат химических наук
3
М.А. Смотряева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы: Основной физиологической функцией фибринолитической
системы (FS) является ограничение тромбообразования и обеспечение внутрисосудистого
кровотока. Ключевым ферментом FS является плазмин, который непосредственно растворяет
фибрин тромба. Плазмин образуется из неактивного предшественника плазминогена под
действием тканевого активатора плазминогена (t-PA), двухцепочечной урокиназы (u-PA) и
одноцепочечной про-урокиназы (scu-PA). В регулировании активности FS участвуют также
ингибиторы плазмина и активаторов плазминогена. Недостаточная активность FS может
стать причиной тромбозов и тромбоэмболических заболеваний таких, как инфаркт миокарда,
инсульт, ишемия и др. В качестве тромболитических агентов используются как
физиологические активаторы плазминогена, так и бактериальный белок стрептокиназа (SK).
В последние годы за рубежом проводятся клинические испытания тромболитического агента
нового поколения - рекомбинантной стафилокиназы (STA), биохимические свойства которой
полностью не изучены.
Скорость образования плазмина зависит как от механизма действия активаторов, так и от
конформации плазминогена. В плазме крови циркулирует, в основном, нативный Gluплазминоген (93 kDa), который под действием образующегося при его активации плазмина
превращается в легче активируемый Lys-плазминоген (85 kDa). Оба плазминогена
существуют в виде двух гликоформ, которые отличаются числом и локализацией
карбогидратных цепей. Показано значительное различие кинетических параметров
активации двух гликоформ Glu-плазминогена фибринспецифичным t-PA, в то время как
кинетические параметры активации двух гликоформ Glu- и Lys-плазминогенов урокиназой и
стафилокиназой не определены.
Благодаря особенностям строения каждого из компонентов FS, их взаимодействия между
собой и с клеточными рецепторами, модулированию этих взаимодействий разными
факторами осуществляется сложное ее функционирование в различных состояниях
организма. Активация или ингибирование активности FS могут быть индуцированы как теми
и иными заболеваниями, так и введением в организм лекарственных и др. средств.
Актуальной задачей является изучение in vitro влияния эффекторов, присутствующих или
образующихся в организме, а также вводимых в организм как лекарственные средства, на
кинетику активации плазминогена его активаторами.
К настоящему времени накопились данные, что FS, помимо тромболизиса, участвует во
многих физиологических и патологических процессах таких, как ремоделирование тканей,
воспаление и заживление ран, ангиогенез, рост и метастазирование опухолей. Опухолевые
клетки высвобождают активаторы плазминогена и их рецепторы, стимулируя тем самым
активацию плазминогена в межклеточном матриксе. Образующийся плазмин вместе с
активированными им металлопротеиназами вызывает деградацию белков в межклеточном
матриксе, создавая условия для миграции эндотелиальных клеток, участвующих в
4
формирования новых сосудов, которые необходимы для роста опухоли. Кроме того,
плазмин, стимулируя разрушение основания мембраны, создает условия для миграции и
инвазии опухолевых клеток в другие ткани и органы. В 1994 году было обнаружено
ингибирование ангиогенеза и роста опухоли продуктом деградации плазмина ангиостатином, представляющим фрагмент первых четырех кринглов его тяжелой цепи.
Получение новых данных о сложном механизме антиангиогенного действия кринглфрагментов плазмин(оген)а является актуальной задачей работы.
Известно, что основной функцией ренин-ангиотензиновой системы (RAS) является
регуляция сосудистого тонуса. Тот факт, что стимулирование RAS увеличивает, а его
ингибирование уменьшает риск сердечно-сосудистых заболеваний, указывает на взаимосвязь
циркуляторных FS и RAS, механизм которой до конца не известен. К настоящему времени
отмечены некоторые функциональные связи циркуляторных FS и RAS человека. Ключевые
компоненты FS и RAS могут влиять на активность и/или высвобождение друг друга, за счет
чего достигается сложная и многоступенчатая регуляция таких процессов, как образование и
лизис тромбов, спазм и расширение сосудов, синтез и расщепление коллагена и адгезивных
белков. Помимо кровотока компоненты этих систем могут присутствовать локально во
многих тканях и органах. Например, в глазу широко представлены компоненты FS и RAS.
Они играют важную роль в патогенезе таких заболеваний, как диабетическая ретинопатия,
глаукома, воспалительные процессы и др. Выявление взаимосвязей FS и RAS при развитии
воспаления и заживлении травмы глаза после ожога роговицы и эффектов ингибиторов двух
систем на эти процессы имеет большое фундаментальное и практическое значение.
Эксперименты in vivo и оценка клинической картины ожоговой болезни глаза кроликов
проводились в ФГУ Московский НИИ глазных болезней им. Гельмгольца Росмедтехнологий
(в лаборатории Биохимии, возглавляемой проф. Чесноковой Н.Б.). Анализ активности ACE в
различных средах глаза проводился на кафедре химической энзимологии химического
факультета МГУ (в группе, возглавляемой в.н.с., к.х.н. Кост О.А.). Эта часть исследований
была выполнена нами в рамках совместного проекта РФФИ (грант № 06-04-49712).
Остальные результаты, включенные в работу, были получены частично в рамках проекта
НТП «Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств
профилактики, диагностики и лечения онкологических, инфекционных и других опасных
заболеваний» (Договора с ФГУП «ГНЦ «НИОПИК» № 34/07- и 34/08-Ген-М).
Цель работы: Целью работы является анализ влияния различных эффекторов на
кинетические закономерности и механизм регуляции активности FS.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
─ исследовать in vitro влияние отдельных эффекторов и их комбинаций на кинетику
активации Glu- и Lys-плазминогенов его активаторами;
─ определить кинетические параметры активации гликоформ 1 и 2 Glu- и Lys-плазминогенов
STA и выяснить роль фибрина и типа гликозилирования зимогена в механизме ее действия;
5
─ изучить влияние ангиостатинов на кинетику активации плазминогена in vitro и
неоангиогенез in vivo;
─ исследовать in vitro перекрестное влияние ингибиторов FS и RAS на активность ключевых
ферментов этих систем;
─ исследовать in vivo изменение уровней ключевых компонентов FS и RAS в жидких средах
и тканях глаз кроликов после ожога роговицы и влияние ингибиторов двух систем на
клиническую картину ожоговой болезни.
Научная новизна работы:
1. Получены новые данные о механизме стимулирования или ингибирования различными
эффекторами кинетики активации разных форм плазминогена его активаторами.
2. Впервые установлено, что фибрин является мощным стимулятором плазминогенактиваторной активности STA и предложен механизм, объясняющий фибринселективность ее действия.
3. Обнаружено перекрестное подавление in vitro активности ключевых ферментов FS и RAS
специфичными ингибиторами этих систем.
4. Впервые выявлена взаимосвязь локальных RAS и FS, функционирующих в жидких средах
и в тканях глаз кроликов в ходе воспалительного процесса. Показано, что ингибиторы
этих систем улучшают процесс репарации ожоговой болезни.
5. Впервые показано, что ингибирование ангиостатинами генерации плазмина из
плазминогена под действием активаторов вовлекается в сложный механизм их
антиангиогенного действия.
Практическая значимость:
Обнаруженное мощное стимулирование фибрином активаторной активности STA, имеет
не только научную, но и практическую значимость для улучшения режима терапии этим
перспективным тромболитическим агентом.
Выявленные изменения уровней ключевых ферментов FS и RAS в жидких средах и
тканях глаз кроликов в ходе развития и репарации воспалительного процесса имеют важное
практическое значение для диагностических целей.
Обнаруженное улучшение процесса репарации ожоговой болезни глаз кроликов при
обработке ингибиторами FS и RAS, используемыми в медицине как антифибринолитические
или гипотензивные агенты, имеют практическую значимость для терапевтических целей.
Найденное улучшение процесса заживления ожоговой болезни глаз кроликов при
введении ангиостатина, имеет практическое значение для терапии.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы были
доложены и обсуждены на следующих конференциях: XLVIII Научной Конференции
Московского физико-технического института (Москва, 2005): V, VI, VII и VIII Ежегодных
международных молодежных конференциях ИБХФ РАН-ВУЗЫ «Биохимическая физика»
(Москва, 2005, 2006, 2007, 2008 гг.); Мoscow Internаtional Conference “Biotechnology and
Medicine” (Moscow, 2006); IV Московском Международном конгрессе «Биотехнология –
6
состояние и перспективы развития», (Москва, 2007); XXI and XXII Congresses of the
International Society on Thrombosis and Haemostasis (Geneva, Switzerland, 2007 and Boston,
USA, 2009); VI Симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007); ХIV
Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007); XIX Congress
of the International Society for Fibrinolysis and Proteolysis (Vienna, Austria, 2008); IV
Всероссийской конференции по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечнососудистой хирургии (Москва 2009); XXII International Conference “Biocatalysis-2009:
fundamentals & applications”(Arkhangelsk, 2009).
Публикации. Материалы диссертационной работы отражены в 26 публикациях, из них: 4
статьи (в том числе 3 работы по списку журналов ВАК) и 22 тезиса докладов на
международных и российских конференциях.
Вклад автора состоит в планировании и проведении экспериментов, обработке их
результатов и творческом участии в интерпретации, обсуждении и оформлении полученных
данных на всех этапах исследования.
Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы,
материалов и методов, результатов и их обсуждения и списка литературы, изложена на 153
страницах машинописного текста и включает 49 рисунков, 20 таблиц и список цитируемой
литературы из 265 наименований.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1 представляет собой обзор литературных данных о структуре и свойствах
основных компонентов FS крови человека. Собраны и обобщены кинетические параметры
активации Glu- и Lys-форм плазминогена его физиологическими активаторами (t-PA, u-PA и
scu-PA) и константы ингибирования плазмина и активаторов плазминогена их
специфическими ингибиторами. В главе 2 рассмотрены механизмы активации плазминогена
активаторами бактериального происхождения (SK и STA), которые используются в
современной терапии тромбозов. В главе 3 собраны литературные данные о влиянии
эффекторов на активацию Glu- и Lys-форм плазминогена под действием u-PA и t-PA. В главе
4 представлены накопившиеся к настоящему времени литературные данные об участии FS в
различных физиологических и патологических процессах таких, как тромболизис,
ремоделирование тканей, воспаление и заживление ран, ангиогенез, рост и метастазирование
опухолей. Обобщены сведения о возможных механизмах образования in vivo кринглфрагментов тяжелой цепи плазмин(оген)а (ангиостатинов), обладающих антиангиогенной и
противоопухолевой активностью. Описаны компоненты FS, найденные в жидких средах и в
отдельных тканях глаза в норме и при патологии. В конце главы приведены обнаруженные к
настоящему времени некоторые функциональные связи циркуляторных FS и RAS человека.
7
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Исходные вещества. А) Основные белковые препараты. В работе использованы: стандартные
u-PA и t-PA (NIBSC, Великобритания); стрептокиназа ("Reyon Pharmaceutical Co. Ltd.",
Корея); рекомбинантная STA, любезно предоставленная Dr. Lijnen H.R. (Center for Molecular
and Vascular Biology, University of Leuven, Бельгия); эластаза из свиной панкреазы (“ICN
Biomedicals, Inc”, Германия); тромбин человека ("Sigma" (США); анцистрон из яда змеи
Agkistrodon halys и фибриноген человека (ООО "Технология-Стандарт", Россия); апротинин
"Гордокс" ("Гедеон Рихтер", Венгрия); замороженная цитратная плазма крови человека
(Гематологический научный центр МЗ России, Москва). Б) Субстраты. Для определения
активностей ферментов использовали: п-нитроанилид HCO-Ala-Phe-Lys (AFK-pNA, ООО
"Технология-Стандарт", Россия); п-нитрофениловый эфир N--карбобензокси-L-Lys,
гидрохлорид (Z-Lys-pNP, синтезированный на кафедре); п-нитроанилид Н-D-Val-Leu-Lys,
дигидрохлорид (S-2251), п-нитроанилид Glp-Gly-Arg, дигидрохлорид (S-2444), пнитроанилид H,D-Ile-Pro-Arg, дигидрохлорид (S-2288) и Nα-3-(2-фурил)акрилоил-Lфенилаланил-глицил-глицин (FA-Phe-Gly-Gly) (“Sigma”, США). В) Ингибиторы: 6Аминогексановая кислота (6-AHA) (“Merck“, Германия); транс-(4-аминометил)циклогексанкарбоновая кислота (t-AMCHA) (“Acros Organics“, США); L-лизин, гидрохлорид,
фенилметансульфонилфторид (PMSF), (2S)-1-(3-Меркапто-2-метилпропионил)-L-пролин
(каптоприл) и (S)-Nα-(1-карбокси-3-фенилпропил)-L-лизил-L-пролин (лизиноприл) (“Sigma”,
США); (S)-1-[N-(1-карбокси-3-фенилпропил)-L-аланил]-L-пролин (эналаприлат) (“KRKA”,
Словения). Г) Антикоагулянты: гепарин ("Sigma", США) и фраксипарин (“Sanofi”, Франция).
Д) Носители: Lys-сефароза 4B, сефадексы G-25 и G-75 (“GE Healthcare”, Швеция).
Методы исследования. Glu-плазминоген (Glu-Pg) выделяли из плазмы человека
аффинной хроматографией на Lys-сефарозе 4B в присутствии апротинина, используя в
качестве элюента 0,2 М 6-AHA (Castellino & Powell, 1981). Lys-плазминоген (Lys-Pg)
выделяли аналогично, но в отсутствие апротинина. Гликоформы Glu-Pg или Lys-Pg типа 1 и
2 разделяли на Lys-сефарозе 4B, используя линейный градиент 0 - 0,012 М 6-AHA.
Полученные образцы Glu-Pg, Lys-Pg и их гликоформ после очистки лиофилизовали.
Растворимый фибрин (дез-АА-фибрин) получали обработкой фибриногена анцистроном.
Ангиостатин К1-3 получали деградацией Glu-Pg эластазой. Ангиостатин К1-4,5 получали
активацией Glu-Pg урокиназой и автолизом полученного плазмина при щелочных значениях
pH. Образцы ангиостатинов после очистки лиофилизовали. Активности ферментов
определяли по скоростям гидролиза их специфических субстратов: AFK-pNA или S-2251
(плазмина и комплекса плазмин-STA), S-2444 (u-PA), S-2288 (t-PA) и FA-Phe-Gly-Gly (ACE).
Кинетику активации разных форм плазминогена (Pg) под действием его активаторов (PA)
изучали в присутствии субстрата (S) плазмина (Pm):
kPg
KPg
PA.Pg
PA + Pg
PA + Pm
Km
Pm + S
(1)
kcat
Pm.S
Pm + p-NA
8
(2)
Образование п-нитроанилина (pNA) в ходе сопряженной реакции (когда [S] >>Km, [Pg]>KPg,
[PA]<<[Pg]) описывается уравнением:
A 405 =
ε M405 k cat k Pg [PA][Pg]
K Pg +[Pg]
t2
(3)
Зависимости A405 от t2 при [PA] = const и переменной [Pg] дают серию прямых, из наклонов
которых (B) определяли начальные скорости активации Pg (vo):
v0 
k [PA][Pg]
B
 Pg
ε M405 k cat
K Pg  [Pg]
(4)
Кинетические параметры активации Pg в отсутствие и присутствии эффекторов определяли из
зависимостей 1/vo от 1/[Pg].
При постоянной [Pg] скорость его активации описывается уравнением:
vакт = A405/t2 = 0,5 × εм 405 × kcat × kPg × [PA]
(5)
За кинетикой активации Pg следили с помощью планшетного фотометра Anthos 2020
(Австрия), соединенного с компьютером и установленного для измерения А405.
В качестве объекта для исследования взаимосвязи FS и RAS in vivo был выбран глаз
кролика, так как он удобен для неинвазивной прижизненной оценки клинических и
биохимических характеристик воспалительного процесса на различных его стадиях в связи с
прозрачностью сред и восполнимостью слезной жидкости. Воспалительный процесс в глазах
кроликов вызывали дозированным щелочным ожогом роговицы. За изменением уровней
компонентов FS и RAS после ожога роговицы следили в слезной жидкости в динамике (28
суток), а в водянистой влаге и гомогенатах тканей глаза - в острый период (3 сутки). На 7, 14,
21 и 28 сутки после ожога оценивали выраженность признаков воспаления, длину и густоту
новообразованных сосудов, площадь и глубину изъязвления роговицы в условных баллах.
Аналогичное исследование было проведено при инстилляции t-AMCHA и каптоприла
(ингибиторов FS и RAS, соответственно).
Статистическую обработку проводили с помощью программы Sigma Plot 7.1.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Характеристика препаратов плазминогена и его крингл-фрагментов
Из донорской плазмы крови человека были получены различные формы плазминогена:
Glu-Pg, Lys-Pg, Glu-Pg1, Glu-Pg2, Lys-Pg1 и Lys-Pg2. Электрофорез очищенных препаратов
Glu-Pg и Lys-Pg представлен на рис.1,А. Lys-форма зимогена лишена N-терминального
пептида (~ 8 kDa) Glu-формы. Гликоформы 1 и 2 имеют те же молекулярные массы, что и
исходные зимогены. Гликоформа 1 плазминогена содержит О-связанную (между кринглами
9
3 и 4) и N-связанную (на крингле 3) карбогидратные цепи, в то время как гликоформа 2 –
только О-связанную карбогидратную цепь.
Рис. 1. SDS-PAA электрофорез в 12 %-ном
геле в не восстанавливающих условиях:
(А) Glu-плазминоген (1) и Lys-плазминоген (2);
(Б) Glu-плазминоген (1), ангиостатин К1-4,5 (2)
и ангиостатин К1-3 (3).
В работе были получены ангиостатины К1-3 и К1-4,5, представляющие первые 3 или 4,5
крингла плазминогена, соответственно (рис. 2). Сравнительный электрофорез Glu-Pg и
полученных из него ангиостатинов К1-3 и К1-4,5 представлен на рис. 1,Б. Наличие двойных
электрофоретических полос очищенных ангиостатинов К1-3 (Mr ~ 35 и 39 kDa) и К1-4,5 (Mr
~ 50 и 55 kDa), вероятно, связано с незначительными различиями в подверженности двух
гликоформ исходного Glu-Pg эластолизу и плазмина автолизу. Отсутствие амидазной
активности плазмина в препаратах ангиостатинов К1-3 и К1-4,5, указывало на полное
удаление легкой цепи плазмина при их очистке.
Рис. 2. Схематическое представление
структуры Glu-плазминогена и кринглфрагментов К1-3 и К1-4,5 его тяжелой
цепи.
2. Влияние эффекторов на кинетику активации различных форм
плазминогена под действием его активаторов in vitro
В
качестве
эффекторов
использовали
NaCl
и
фибрин,
присутствующий
или
образующийся в организме, соответственно, а также гепарины, ангиостатины и ингибиторы
ACE, которые могут вводиться в организм как лекарственные средства.
10
Çàâèñèì î ñòü ñêî ðî ñòè àêòèâàöèè Glu-Pg (1 M),
Влияние
хлорид-ионов
и êèí
гепаринов
èí èöèèðî âàí фибрина,
í î é 0,25 IU/ml t-PA
(1), 0,13 nM ñòàô èëî
àçî é (2) è

0,25 IU/ml u-PA (3) î ò êî í öåí òðàöèè ðàñòâî ðèì î ãî ô èáðèí à (37 Ñ, pH 7,4).
Ñêî ðî ñòü àêòèâàöèè, %
На рис. 3 представлено влияние концентрации растворимого фибрина на скорость
активации Glu-Pg под действием t-PA, u-PA и STA. Из рисунка следует, что фибрин является
мощным стимулятором плазминоген-активаторной активности не только t-PA, обладающего
сродством к фибрину, но и STA, хотя STA, как и u-PA, прямо не связывается с фибрином.
3
100
Рис. 3. Зависимость скорости активации
1 M Glu-Pg, индуцированной 0,25 IU/
ml t-PA (1), 0,13 nM стафилокиназой (2)
и 0,25 IU/ml u-PA (3), от концентрации
2
80
1
60
40
растворимого фибрина (37º, pH 7,4).
p<0,01.
20
0
0
20
40
60
80
100
120
140
Ðàñòâî ðèì û é ô èáðèí , nM
Сравнительное изучение влияния фибрина на кинетические параметры активации Glu-Pg-1,
Glu-Pg-2, Lys-Pg-1 и Lys-Pg-2 комплексом плазмин(Pm)-STA показало (табл. 1), что он
значительно потенцирует активацию всех четырех зимогенов, вызывая повышение
каталитической эффективности реакции (kPg/KPg) в 13-40 раз только за счет снижения KPg.
Таблица 1. Кинетические параметры активации гликоформ Glu- и Lys-плазминогенов
комплексом Pm-STA в отсутствие и присутствии 60 nM растворимого фибрина.
Форма
плазминогена
KPg, μM
kPg, s-1
kPg/KPg, μM-1 s-1
Эффект Fm*
В отсутствие фибрина:
Glu-Pg1
17,1 ± 0,2
0,082 ± 0,001
4,78.10-3
Glu-Pg2
14,9 ± 0,1
0,094 ± 0,002
6,30.10-3
Lys-Pg1
11,2 ± 0,1
0,089 ± 0,003
7,92.10-3
Lys-Pg2
5,3 ± 0,1
0,098 ± 0,002
18,25.10-3
В присутствии фибрина:
Glu-Pg1
1,30 ± 0,01
0,081 ± 0,001
62,40.10-3
13,05
Glu-Pg2
0,36 ± 0,02
0,096 ± 0,002
261,58.10-3
41,5
Lys-Pg1
0,44 ± 0,02
0,078 ± 0,001
177,68.10-3
22,4
Lys-Pg2
0,20 ± 0,01
0,096 ± 0,003
497,41.10-3
27,2
*Отношение значений kPg/KPg в присутствии и в отсутствие фибрина.
11
Этот эффект можно объяснить следующим образом. Как только каталитическая
концентрация комплекса Pm-STA инициирует активацию плазминогена в плазмин,
начинается деградация фибрина с экспонированием его С-терминальных лизинов – новых
центров для связывания плазминогена. STA значительно сильнее связывается с Lys-Pg и GluPg, сорбированным на частично деградированном фибрине, чем с зимогенами в растворе. В
результате аккумулирования плазминогенов на поверхности частично деградированного
фибрина и разворачивания их молекул, повышающего доступность STA-связывающих
участков зимогенов, эффективность фермент-субстратного комплекса и скорость активации
увеличиваются. На основании анализа кинетических параметров активации двух гликоформ
плазминогенов сделан вывод о том, что N-гликозилирование крингла 3 гликоформы 1
плазминогенов создает стерические затруднения для образования фермент-субстратного
комплекса Pm.STA.Pg в растворе и на поверхности фибрина.
В работе изучено влияние нефракционированного гепарина (Mr
~ 15 kDa) и
фракционированного гепарина (фраксипарина, Mr ~ 4-6,5 kDa), которые используются в
терапии как антикоагулянты, на активацию Glu-Pg1 и Lys-Pg1 под действием комплекса
Pm.STA и u-PA. Было обнаружено, что скорость активации плазминогенов повышается с
Таблица 2. Влияние отдельных эффекторов и их комбинаций на кинетические параметры
активации Glu-Pg1 и Lys-Pg1.комплексом Pm-STA (рН 8,3; 37°С).
Препарат
Glu-Pg1
Lys-Pg1
Эффектор*
KPg, µМ
kPg, s-1
KPg/KPg, (µМ.s)-1
-
3,6 ± 0,2
0,090 ± 0,001
0,025
NaCl
20,8 ± 0,2
0,082 ± 0,002
0,00393
Fx
3,6 ± 0,1
0,27 ± 0,01
0,075
Fx + NaCl
20,8 ± 0,2
0,082 ± 0,003
0,00393
Hp + NaCl
20,8 ± 0,2
0,082 ± 0,002
0,00393
Fm + NaCl
1,6 ± 0,1
0,067 ± 0,004
0,0435
Fm + Fx + NaCl
0,53 ± 0,01
0,060 ± 0,002
0,113
Fm + Hp + NaCl
0,83 ± 0,01
0,063 ± 0,003
0,076
-
0,66 ± 0,01
0,196 ± 0,002
0,298
NaCl
9,2 ± 0,1
0,069 ± 0,003
0,0073
Fx
0,73 ± 0,02
0,26 ± 0,01
0,358
Hp
0,64 ± 0,03
0,165 ± 0,004
0,260
Fx + NaCl
9,2 ± 0,1
0,069 ± 0,002
0,0073
Hp + NaCl
9,2 ± 0,1
0,069 ± 0,003
0,0073
Fm + NaCl
0,38 ± 0,02
0,071 ± 0,002
0,1913
Fm + Fx + NaCl
0,47 ± 0,01
0,074 ± 0,004
0,1578
Fm + Hp + NaCl
0,83 ± 0,01
0,077 ± 0,004
0,0930
[Fx] = 0,4 IU/ml; [Hp] = 4 IU/ml; [Fm] = 0,02 mg protein/ml; [NaCl] = 0,11 М.
12
ростом концентрации фраксипарина до 0,4 IU/ml (затем уменьшается) и падает с ростом
концентрации гепарина. Хлорид ионы в концентрации, близкой к физиологической,
полностью подавляли стимулирующий эффект фраксипарина. В табл. 2 приведены
найденные значения кинетических параметров активации Glu-Pg1 и Lys-Pg1 под действием
комплекса Pm-STA в отсутствие и в присутствии отдельных эффекторов и их комбинаций.
Как видно, фраксипарин (0,4 IU/ml) повышает скорость активации обоих зимогенов за счет
увеличения kPg, что указывает на повышение доступности активационной связи обоих
зимогенов для активатора при их связывании с фраксипарином. Известно, что Glu-Pg имеет
“закрытую” конформацию в присутствии хлорид-ионов, “полуоткрытую” и “открытую”
конформацию при сорбции на интактном и частично деградированном фибрине,
соответственно. Из данных табл. 2 видно, хлорид-ионы подавляют слабый стимулирующий
эффект фраксипарина за счет увеличения KPg, стабилизируя как “закрытую” конформацию
Glu-Pg1, так и “полуоткрытую” конформацию Lys-Pg1. Отрицательный эффект хлоридионов элиминируется при добавлении фибрина, который стабилизирует более открытую
конформацию обоих плазминогенов за счет резкого снижение KPg.
Отрицательный эффект хлорид-ионов (снижение (kPg/KPg) наблюдался и для активации
этих плазминогенов урокиназой (табл. 3).
Таблица 3. Влияние гепарина и фраксипарина на кинетические параметры активации GluPg1 и Lys-Pg1 урокиназой (рН 8,3, 37°С).
Препарат
Glu-Pg1
Lys-Pg1
Эффектор*
KPg, μМ
kPg, s-1
kPg/ KPg, (μМ.s)-1
-
0,20 ± 0,01
0,15 ± 0,01
0,765
NaCl
1,06 ± 0,03
0,15 ± 0,02
0,145
Фраксипарин
0,33 ± 0,01
0,31 ± 0,02
0,924
Гепарин
0,33 ± 0,02
0,31 ± 0,03
0,924
-
0,10 ± 0,01
0,17 ± 0,02
1,627
NaCl
0,73 ± 0,02
0,28 ± 0,01
0,383
Фраксипарин
0,10 ± 0,02
0,26 ± 0,01
2,6
Гепарин
0,10 ± 0,01
0,35 ± 0,02
3,4
[Fx] = 0,4 IU/ml; [Hp] = 4 IU/ml; [NaCl] = 0,11 М.
Влияние ангиостатинов
Было изучено влияние двух ангиостатинов на активацию Glu-Pg под действием его
физиологических активаторов in vitro. Обнаружено, что ангиостатины К1-3 и К1-4,5 дозазависимым образом ингибируют реакцию превращения Glu-Pg в плазмин, индуцированную
u-PA в растворе (рис. 4, А). В связи с тем, что t-PA является эффективным активатором
плазминогена только в присутствии фибрина, было изучено влияние ангиостатинов на
фибрин-стимулированную активацию Glu-Pg под действием t-PA. Обнаружено, что К1-4,5
13
Ñêî ðî ñòü àêòèâàöèè, %
âë è ÿí è å àí ãè î ñòàòè í î â Ê1-3 è Ê1-4,5 à àê òè âàöè þ Glu-ï ë àçì è í î ãåí à ï î ä äåé ñòâè åì u-PA â î òñóòñòâè å (À) t-PA â
Á
À
100
1
100
1
80
80
60
60
2
40
40
20
2
20
0
0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
0,0
Àí ãèî ñòàòèí , M
0,5
1,0
1,5
2,0
Àí ãèî ñòàòèí , M
Рис. 4. Доза-зависимое влияние ангиостатинов К1-3 (1) и К1-4,5 (2) на активацию Glu-Pg под
действием u-PA в отсутствие фибрина (А) и t-PA в присутствии фибрина (Б). p<0,01.
сильно тормозит скорость активации Glu-Pg под действием t-PA, в то время как К1-3,
практически не влияет на эту реакцию (рис. 4, Б). Последнее можно объяснить тем, что
ангиостатин К1-3 лишен крингла 5, обладающего наибольшим сродством к фибрину.
Причиной эффектов ангиостатинов на скорость активации плазминогена, измеренной
сопряженным методом (уравнения (1) и (2)), могло быть их влияние на собственные
активности активатора плазминогена или плазмина. Отдельно проведенный эксперимент по
гидролизу плазмином, u-PA и t-PA их специфических субстратов в присутствии высоких
концентраций ангиостатинов К1-3 и К1-4,5 показал, что они не влияют на амидазные
активности плазмина, u-PA и t-PA. Следовательно, ангиостатины ингибируют генерацию
плазмина из плазминогена под действием его активаторов. Для выяснения механизма
ингибирования было изучено влияние ангиостатина К1-4,5 на кинетические параметры
активации Glu-Pg двумя активаторами. Из данных табл. 4 видно, что при повышении
концентрации ангиостатина kPg не изменяется, а КPg активации плазминогена урокиназой
Таблица 4. Влияние ангиостатина К1-4,5 на кинетические параметры активации Glu-Pg под
действием 0,25 IU/ml u-PA в отсутствие или t-PA в присутствии фибрина (60 nM) (p < 0,01)
[К1-4,5], μM
KPg, μM
kPg, s-1
kPg/KPg, s-1 μM-1
u-PA
0
0,3
1,2
0
0,3
1,2
0,020
0,018
0,020
0,52
0,79
1,81
t-PA + фибрин
0,086
0,023
0,06
0,048
0,04
0,071
14
0,039
0,023
0,011
3,74
1,25
0,56
увеличивается, что указывает на конкурентный тип ингибирования ангиостатином
активаторной активности u-PA. В случае t-PA, увеличение концентрации K1-4,5 приводит к
уменьшению kPg и увеличению KPg активации. Следовательно, ангиостатин K1-4,5
ингибирует фибрин-стимулированную активацию Glu-Pg под действием t-PA по
смешанному типу. В работе предложен механизм ингибирования двух реакций. Константы
ингибирования (Ki) ангиостатином К1-4,5 активации Glu-Pg были найдены равными 0,59 μM
(в случае u-PA) и 0,12 μM (в случае t-PA).
Влияние ингибиторов RAS
В работе изучено влияние трех различных по химической структуре ингибиторов ACE:
на амидазные активности плазмина, t-PA и u-PA in vitro и обнаружено, что лизиноприл и
эналаприлат не влияют, а каптоприл значительно ингибирует амидазные активности
плазмина (рис. 5,А) и u-PA (рис. 5,Б). Влияние каптоприла на активность t-PA была
Ðè ñ. 6. Äî çîингибирования,
-çàâè ñè ì û å ýô ô åê òûвозможно,
ê àï òî ï ðè ë à íсвязан
à àì è äàçíсû восстановлением
å àê òè âí î ñòè :
аналогичной. Механизм
SH-группой
(À) ï ë àçì è í à ([ï ë àçì è í à], nÌ : 1 (1), 5 (2), 10 (3)) è
каптоприла дисульфидных
связей
которое
(Á) u-PA
([u-PA],ферментов,
nÌ : 18,75 (1), 37,5
(2), 75 (3)).вызывает
(p < 0,01). обратимое нарушение
интактности их активных центров.
Àê òè âí î ñòü, A/min
0,04
0,04
À
Á
3
0,03
0,03
0,02
3
0,02
2
0,01
2
0,01
1
1
0,00
0,00
0
1
2
3
4
5
Êàï òî ï ðèë, mM
0
1
2
3
4
5
Êàï òî ï ðèë, mM
Рис. 5. Дозо-зависимые эффекты каптоприла на амидазные активности: (А) плазмина ([Pm],
nМ: 1 (1), 5 (2), 10 (3)) и (Б) урокиназы ([u-PA], nМ: 18,75 (1), 37,5 (2), 75 (3)). (p < 0,01).
Изучение влияния ингибиторов ACE на кинетику активации Glu-Pg показало (рис. 6), что
эналаприлат не влияет, а каптоприл ингибирует активаторные активности u-PA и t-PA с
15
близкими значениями [IC]50. Лизиноприл стимулирует активаторную активность u-PA и
ингибирует активаторную активность t-PA. Возможно, стимулирование лизиноприлом
активации Glu-Pg под действием u-PA обусловлено тем, что связывание лизиноприла через
положительно заряженный боковой остаток лизина с LBS Glu-Pg разрушает лизинзависимые взаимодействия в молекуле зимогена, что приводит к изменению его закрытой
è å ðàçë è ÷í û õ êконформации
î í öåí òðàöè é ýí
àë àï ðè
ë àòà (1), ëи,
è çè
í î ï ðè ë à (2) è êкàïросту
òî ï ðèскорости
ë à (3) ñê îего
ðî ñòü
àê òè âàöè è 0,3 Ì Glu-Pg ï î
в более
открытую
соответственно
активации.
Ñêî ðî ñòü àêòèâàöèè, A/h2
A + ðàñòâî ðè ì û é ô è áðè í (Á). (p < 0,01).
0,8
0,8
Á
A
2
0,6
0,4
1
0,6
2
0,4
1
0,2
0,2
3
3
0,0
0,0
0
5
10
15
20
25
0
Èí ãèáèòî ð, mM
5
10
15
20
Èí ãèáèòî ð, mM
Рис. 6. Влияние концентраций эналаприлата (1), лизиноприла (2) и каптоприла (3) на
скорость активации 0,3 М Glu-Pg под действием 0,75 IU/ml u-PA (А) и 2 IU/ml t-PA +
растворимый фибрин (Б). (p < 0,01).
Ингибирующее действие лизиноприла на фибрин-стимулированную активацию Glu-Pg под
действием t-PA может быть связано с тем, что положительно заряженный боковой остаток
лизина молекулы ингибитора конкурирует с фибрином за связывание плазминогена и,
возможно, t-PA. Вытеснение последних с поверхности фибрина лизиноприлом приводит к
снижению скорости активации.
Полученные результаты демонстрируют, что ингибиторы ACE (каптоприл и лизиноприл)
влияют на активность ключевых ферментов FS in vitro.
3. Влияние эффекторов FS на активность ACE in vitro
В качестве эффекторов FS были использованы: плазмин, гепарин и растворимый фибрин,
а также ингибиторы фибринолиза – 6-AHA и t-AMCHA. Обнаружено, что плазмин и гепарин
во всем изученном диапазоне их концентраций не влияют, фибрин слабо ингибирует, а
ингибиторы FS - 6-AHA и t-AMCHA - значительно подавляют активность ACE in vitro (рис.
7).
16
àâèñèì î ñòü àêòèâí î ñòè ACE (0.2 í Ì ) î ò êî í öåí òðàöèè 6-AHA (1) t-AMCHA (2). (p < 0,01).
100
Àêòèâí î ñòü, %
80
Рис. 7. Зависимость активности ACE
60
(0,2 нМ) от концентрации 6-AHA (1) и
1
t-AMCHA (2). (p < 0,01).
40
2
20
0
1
10
100
Èí ãèáèòî ð, mM
Таким
образом,
впервые
обнаружено
перекрестное
влияние
терапевтических
концентраций ингибиторов FS и RAS, применяемых в медицине как антифибринолитические
или гипотензивные агенты, соответственно, на активности ключевых ферментов этих систем
in vitro.
4. Взаимосвязь FS и RAS в воспалительном процессе глаз кроликов
Уровни компонентов FS и ACE в водянистой влаге и гомогенатах тканей глаза в
норме и после ожога роговицы
Поскольку водянистую влагу, находящуюся в передней камере глаза, и различные ткани
глаза можно отобрать только один раз (до и после энуклеации глаза, соответственно)
измерения уровней компонентов FS и ACE в этих средах глаза проводили только в норме и в
острый период (на 3-и сутки) после ожога роговицы. Результаты исследования представлены
на рис. 8. Как видно, в тканях глаза кроликов, как в сосудистых, так и в бессосудистых, и во
влаге передней камеры в норме и после ожога обнаруживаются компоненты RAS и FS. В
острый период воспаления, вызванного ожогом, их активность существенно изменяется. При
этом повышается активность плазмина во всех тканях, плазминогена - значительно в
цилиарном теле и роговице, активаторов плазминогена - многократно в конъюнктиве и
значительно в сетчатке и хориоидее, ACE – во всех тканях, кроме сетчатки и хориоидеи. В
водянистой влаге значительно возрастает активность плазмина, плазминогена и ACE. Из
результатов следует, что после травмы роговицы происходит активация FS и RAS не только
в области повреждения и в прилежащих тканях, но и во внутренних структурах глаза. Эти
изменения в связи с важной ролью изучаемых систем в гемоциркуляции и воспалении могут
явиться причиной развития осложнений во внутренних структурах глаза, возникающих
после ожога роговицы.
17
0,12 0,02
Рис. 8. Уровни компонентов FS и RAS в
гомогенатах
различных
тканей
глаза
кроликов и во влаге передней камеры (на
вставках) ( - здоровые животные,
- 3-и
сутки после ожога роговицы). p < 0.05.
À
0,10
0,08 0,01
0,06
0,04
0,00
(А) Удельная активность плазмина в
гомогенатах тканей глаза кроликов в
μM/min×mg. На вставке активность плазмина
в водянистой влаге в (μM/min×ml)× 105.
0,02
0,00
2,0
2,0
Á
1,6 1,5
1,2
(Б) Удельная потенциальная активность
плазминогена в гомогенатах тканей глаза
кроликов в μM/min×mg. На вставке
активность плазминогена в водянистой влаге
в μM/min×ml.
1,0
0,5
0,8
0,0
0,4
0,0
30
12
25
20
15
10
Â
8
4
0
(В)
Суммарная
удельная
активность
активаторов плазминогена в гомогенатах
тканей глаза кроликов в nM/min×mg. На
вставке
активность
активаторов
плазминогена в водянистой влаге в
(μM/min×ml) × 104.
5
0
Ã
30
1,0
20
0,5
0,0
10
(Г) Удельная активность ACE в гомогенатах
тканей глаза кроликов в (μM/min×mg)×104.
На вставке активность ACE в водянистой
влаге в (μM/min×ml)×104.
Ñ
Õð
òå óñ
êë òà
î â ëè
.ò ê
Ðà åë
ä î
Ö óæ
èë ê
. à
Ñ òåë
å
Õî ò÷à î
ðè òê
à
î
Ðî è ä
Êî ãî åÿ
í ü âè
þ öà
êò
èâ
à
0
18
Уровни компонентов FS в слезной жидкости в норме и после ожога роговицы глаза
Известно, что состав слезной жидкости отражает метаболический статус как внешних,
так и внутренних структур глаза, поэтому определение содержания компонентов FS и RAS в
слезной жидкости может иметь диагностическое и прогностическое значение. В связи с тем,
что восполняемую слезную жидкость можно отбирать многократно, в работе впервые была
изучена динамика изменения уровней компонентов FS в слезной жидкости в ходе всего
процесса воспаления и заживления роговицы, которая была сопоставлена с результатами
изменения активности ACE в слезе, полученными ранее.
В норме в слезе были обнаружены измеримые, но не высокие уровни t-PA, u-PA, Pg и
плазмина (Pm), что, вероятно, достаточно для поддержания проходимости слезного протока
и прозрачности слезы благодаря предотвращению образования фибринового сгустка.
Воспалительный процесс, вызванный ожогом, начинался с разрушения верхнего слоя
эпителия и помутнения роговицы, что сопровождалось высвобождением в слезу
компонентов FS и ACE. Через 3 дня после ожога дефект эпителия закрывался, а отек и
проницаемость сосудов увеличились. В последующие дни вновь обнажалась строма
роговицы, в которой начинался процесс изъязвления, который достигал максимума на 14–21
сутки. Через 28 дней воспалительный процесс затухал и на месте ожога формировалась
рубцовая ткань. Нами было обнаружено два пика подъема уровней Pg и t-PA на 3 и 21 сутки,
а Pm и u-PA на 7 и 21 сутки в слезе после травмы (рис. 9).
Á
À
Àêòèâí î ñòü, %
600
600
1
400
400
1
2
200
2
200
0
0
01 3
7
14
Cóòêè
21
28
01 3
7
14
Cóòêè
21
28
Рис. 9. Динамика изменения уровней компонентов FS в слезной жидкости после ожога
роговицы глаза в сравнении с их контрольными уровнями: (A) t-PA (1) и u-PA (2); (Б) Pg (1)
и Pm (2). p < 0,05.
19
Два пика роста активности ACE на 3 и 21 сутки было также обнаружено ранее Кост О.А.
с соавторами. Таким образом, повышение уровней Pg, t-PA и ACE на 3 сутки и активности
Pm и u-PA на 7-ой день является показателем интенсификации воспаления. Повторный
скачок уровней u-PA, t-PA, Pg, Pm и ACE между 14-21 днями указывает на их важную роль в
изъязвлении, а измеримые остаточные уровни u-PA и Pm на 28 день – на их участие в
процессе репарации роговицы.
Поскольку ожог роговицы вызывает повышение активности ключевых ферментов FS и
RAS не только в тканевых структурах и водянистой влаге, но и в слезной жидкости нами
было решено исследовать взаимное влияние инстилляций ингибиторов двух систем на
уровни их компонентов в слезе. Было впервые проведено исследование влияния ежедневных
инстилляций 1%-ного каптоприла или 2% t-AMCHA на активность компонентов FS и ACE
на разных стадиях воспалительного ожогового процесса (рисунки не приведены) и на
клинические проявления болезни.
Клинические проявления ожоговой болезни глаз
Лечение t-AMCHA. По интенсивности неоваскуляризации роговицы – прорастанию
сосудов из лимбальной области к центру роговицы, опытная группа, получавшая лечение t-
2,5
7
Á
A
6
Ï ëî ù àäü äåô åêòà,
óñë. åä.
Èí òåí ñèâí î ñòü í åî âàñêóëÿðèçàöèè,
óñë. åä
AMCHA превосходила контрольную (рис. 10, А). Достоверные клинические различия от
5
4
3
2
2,0
1,5
1,0
0,5
1
0,0
0
0
7
14
21
28
2,5
0
7
14
Cóòêè
21
Ãëóáèí à äåô åêòà,
óñë. åä.
Â
2,0
Рис. 10. Влияние ежедневных
1,5
инстилляций 2% t-AMCHA в
течение 14 дней на клиническую
картину при ожоге роговицы:
- t-AMCHA; ● - фосфатный
буфер. (p < 0,01).
1,0
0,5
0,0
0
7
14
21
28
Cóòêè
20
28
нелеченых животных отмечены на 21 сутки (р<0,05) при ежедневном введении ингибитора.
Последующее запустевание новообразованных сосудов у леченых животных также
происходило быстрее. При оценке развития и заживления язвы роговицы выявлено, что в
группе, получавшей t-AMCHA, наблюдались значительно меньшая площадь и глубина
дефекта и более быстрое его заживление, при этом достоверные отличия от контрольной
группы по площади дефекта отмечены на 21 сутки (p<0,05), по глубине – на 28 сутки
(p<0,02) (рис. 10, Б и В).
Применение ингибитора плазмина - t-AMCHA значительно улучшило течение
репаративных процессов после ожога: снизились глубина и площадь изъязвления роговицы.
Сосуды прорастали в роговицу более интенсивно, но в то же время происходило их более
раннее запустевание, что способствовало образованию более нежной рубцовой ткани.
Клинические проявления послеожогового процесса коррелировали с интенсивностью
изменения активности ACE в слезной жидкости. Однако мы не обнаружили такой жесткой
корреляции с активностью компонентов FS в слезной жидкости. Вероятно, это связано с
влиянием большого числа факторов на наблюдаемую секрецию каждого белка сложной
многокомпонентной FS.
Лечение каптоприлом. В опытной группе животных, которым после ожога ежедневно
вводили каптоприл, по сравнению с контрольной группой также наблюдалось более
интенсивное прорастание сосудов из лимбальной области к центру роговицы и после 14
суток запустевание новообразованных сосудов. Инстилляции каптоприла существенно
снижали частоту развития глубоких язв роговицы (данные не приведены). Таким образом,
обнаружен положительный эффект введения как ингибитора плазмина, так и ингибитора
ACE в глаза кроликов на течение клинической ожоговой болезни.
Влияние ангиостатина на неоваскуляризацию роговицы глаза, вызванную ожогом.
Неоваскуляризация роговицы на ранних сроках имеет положительное значение, т.к.
обеспечивает поступление необходимых метаболитов для репарации бессосудистой в норме
роговицы, а на поздних сроках имеет отрицательное значение, так как задержка запустевания
сосудов приводит к формированию грубого васкуляризированного бельма. Выше было
показано, что инстилляции каптоприла и t-AMCHA усиливают васкуляризацию на ранних
сроках после ожога роговицы и вызывают более раннее запустевание сосудов, что
благоприятно для образования более прозрачной рубцовой ткани.
FS играет важную роль в регуляции неоваскуляризации роговицы. Предполагается, что в
запуске этого процесса ключевую роль играет активация плазминогена под действием u-PA,
содержащейся в строме периферической части роговицы. Поэтому нами было изучено
21
влияние ангиостатина К1-4,5 на неоваскуляризацию роговицы глаз у кроликов после ожога.
Ангиостатин вводили ежедневно в виде субконъюнктивальных инъекций в течение 3 недель,
начиная со дня нанесения ожога роговицы. Результаты исследования эффекта ангиостатина
A
8
6
4
2
0
4
Á
3
2
1
0
0
Ãóñòî òà í î âî î áðàçî âàí í û õ
ñî ñóäî â, óñë. åä.
Äëèí à í î âî î áðàçî âàí í û õ
ñî ñóäî â, óñë. åä.
Èí òåí ñèâí î ñòü
í åî âàñêóëÿðèçàöèè, óñë. åä.
in vivo представлены на рис. 11. Как видно, у животных, получавших ангиостатин, длина (Б)
7
14
21
28
35
0
7
14
21
28
35
Ñóòêè
3,0
Â
2,5
Рис. 11. Влияние ангиостатина К14,5 на неоваскуляризацию роговицы
глаз у кроликов, вызванную ожогом:
- К1-4,5; - контроль.
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0
7
14
21
28
35
Ñóòêè
и густота сосудов (В), а также интенсивность неоваскуляризации (А) были заметно ниже,
чем у контрольных животных. В опытной группе запустевание новообразованных
происходило также быстрее, чем в контрольной группе.
Таким образом, полученные в данной работе in vivo результаты подтверждают
предположение, сделанное нами на основании in vitro результатов, что одним из механизмов
сложного антиангиогенного действия ангиостатинов является ингибирование генерации
плазмина из плазминогена под действием физиологических активаторов плазминогена.
22
ВЫВОДЫ
1. Изучено влияние фибрина, хлорид-ионов, гепарина, фраксипарина и их комбинаций на
кинетику активации различных форм плазминогена его активаторами и получены новые
данные о механизме их стимулирующего или ингибирующего действия.
2. Впервые определены кинетические параметры активации гликоформ 1 и 2 Glu- и Lysплазминогенов стафилокиназой и обнаружено, что фибрин значительно стимулирует
активацию гликоформы 2 и в меньшей степени гликоформы 1 плазминогенов.
3. Впервые показано, что ангиостатины - крингл-фрагменты К1-3 и К1-4,5 плазминогена ингибируют in vitro генерацию плазмина из плазминогена под действием его
физиологических активаторов и предложен механизм ингибирования.
4. Обнаружено перекрестное ингибирование in vitro активности ключевых ферментов
фибринолитической (FS) и ренин-ангиотензиновой систем (RAS) ингибиторами этих
систем.
5. Впервые проведено сравнительное изучение изменений уровней компонентов FS и RAS в
воспалительном процессе, вызванном ожогом роговицы глаз кроликов и обнаружено:
а) Увеличение уровня ключевых ферментов двух систем в водянистой влаге передней
камеры и в тканях глаза (хрусталике, стекловидном теле, радужке, цилиарном теле,
сетчатке, хориоидее, роговице и конъюнктиве) в острый период ожоговой болезни;
б) Повышение активности ключевых ферментов RAS и FS в слезной жидкости, в острый
период и в период максимального изъязвления роговицы;
в) Улучшение клинической картины ожоговой болезни глаз кроликов (снижение площади
и глубины дефекта и более быстрое заживление язвы роговицы) при инстилляции как
ингибитора RAS, так и ингибитора FS.
Таким образом, обнаружена взаимосвязь локальных RAS и FS, функционирующих в
жидких средах и в тканях (сосудистых и бессосудистых) глаз кроликов. Обе системы
участвуют в развитии воспалительного процесса, а их ингибиторы улучшают процесс
заживления язвы роговицы, вызванной ожогом.
6. Показано, что ангиостатины ингибируют неоваскуляризацию, индуцированную ожогом
роговицы глаз кроликов in vivo и основным фактором роста в подкожных имплантатах
мышей ex vivo. Из in vitro и in vivo результатов следует, что ингибирование
ангиостатинами генерации плазмина из плазминогена является одним из механизмов их
сложного антиангиогенного действия.
23
Основное содержание диссертации опубликовано в следующих публикациях:
1. Gulin D.A., Mukhametova L.I., Aisina R.B., Varfolomeyev S.D. Сorrelation between Gluplasminogen conformation and kinetic parametres of its activation by staphylokinase // Progress
in Chemical and Biochemical Physics, Kinetics and Thermodynamics, 2008, Nova Science
Publishers, N.-Y. Editors: G.E. Zaikov, P. 91-102.
2. Мухаметова Л.И. Гулин Д.А., Биневский П.В., Айсина Р.Б., Кост О.А., Никольская И.И.
Перекрестное влияние ингибиторов ренин-ангиотензиновой и фибринолитической
систем на их ключевые ферменты in vitro // Биоорганическая химия, 2008, Т. 34, № 4, С.
471-478.
3. Чеснокова Н.Б., Никольская И.И., Мухаметова Л.И., Кост О.А., Айсина Р.Б., Безнос О.В.,
Столярова Е.П., Гулин Д.А., Биневский П.В. Компоненты фибринолитической и ренинангиотензиновой систем в тканевых структурах и жидких средах глаза кроликов в норме и
после ожога роговицы // Российский офтальмологический журнал, 2008, Т. 1, № 2, С. 4650.
4. Айсина Р.Б., Мухаметова Л.И., Гулин Д.А., Левашов М.Ю., Присяжная Н.В., Гершкович
К.Б., Варфоломеев С.Д. Ингибирующие эффекты ангиостатина на активность системы
плазминоген/активаторы плазминогена // Биохимия, 2009, Т. 74, С. 1356 – 1367.
5. Moukhametova L.I., Aisina R.B., Gershkovich K.B., Gulin D.A., Varfolomeyev S.D. Influence
of fibrin-monomer on activation of Glu- and Lys-forms of plasminogen by staphylokinase //
Intern. Congress on Thrombosis, Haemostasis and Vascular Pathology, 14th Meeting of the
Danubian League against Thrombosis and Haemorragic disorders, Symposium of the AllRussian Association on Thrombosis, Haemostasis and Vascular Pathology, St. Peterburg,
Russia, 2004, P. 36.
6. Гулин Д.А., Мухаметова Л.И., Айсина Р.Б., Гершкович К.Б., Варфоломеев С.Д. Активация
Glu- и Lys-форм плазминогена рекомбинантной стафилокиназой в присутствии фибринмономера // XLVIII Научная Конференция Московского физико-технического института,
Москва, 2005, С. 43.
7. Гулин Д.А., Мухаметова Л.И., Айсина Р.Б., Гершкович К.Б. Активация Glu1- и Lys1-форм
плазминогена рекомбинантной стафилокиназой в присутствии фраксипарина // V
Ежегодная международная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗЫ "Биохимическая
физика", Москва, 2005, С. 52.
8. Gulin D.A., Mukhametova L.I., Gershkovich K.B., Aisina R.B., Varfolomeyev S.D. Effect of
heparins on the activation kinetics of Glu-plasminogen and Lys-plasminogen by staphylokinase
// Moscow International Conference “Biotechnology and Medicine”, Moscow, 2006, P. 212.
9. Гулин Д.А., Мухаметова Л.И., Айсина Р.Б., Варфоломеев С.Д. Взаимосвязь конформации
Глу-плазминогена и кинетическими параметрами его активации стафилокиназой // VI
24
Ежегодная международная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗЫ "Биохимическая
физика", Москва, 2006, C. 43.
10. Гулин Д.А., Мухаметова Л.И., Айсина Р.Б., Присяжная Н.В., Варфоломеев С.Д.,
Чеснокова Н.Б. Влияние ингибиторов ренин-ангиотензиновой системы на активацию
плазминогена in vitro // VII Ежегодная международная молодежная конференция ИБХФ
РАН-ВУЗЫ "Биохимическая физика", Москва, 2007, С. 47.
11. Gulin D.A., Mukhametova L.I. Role of components of local fibrinolytic system of rabbit eye in
inflammation and healing of cornea // IV Московский Международный конгресс
«Биотехнология – состояние и перспективы развития», Москва, 2007, С. 280.
12. Айсина Р.Б., Мухаметова Л.И., Гулин Д.А., Ларин С.С., Князев А.И., Гершкович К.Б.,
Левашов М.Ю., Варфоломеев С.Д. Тест-система для оценки антиангиогенной активности
ангиостатин-подобных
фрагментов
плазминогена
in
vitro
//
ХIV
Российский
Национальный Конгресс «Человек и лекарство», Москва, 2007, С. 604.
13. Мухаметова Л.И., Гулин Д.А., Присяжная Н.В., Айсина Р.Б., Никольская Н.И., Кост О.А.,
Чеснокова Н.Б. Влияние ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента на
компоненты фибринолитической системы in vitro // ХIV Российский Национальный
Конгресс «Человек и лекарство», Москва, 2007, С. 160-161.
14. Мухаметова Л.И., Гулин Д.А., Присяжная Н.В., Крамор Р.В., Айсина Р.Б. Влияние
гипотензивных препаратов на протеолитическую активность плазмина и активаторов
плазминогена in vitro // VI Симпозиум «Химия протеолитических ферментов», Москва,
2007, C. 160.
15. Aisina R.B., Mukhametova L.I., Gulin D.A., Larin S.S., Gershkovich K.B., Levashov M.Y.,
Varfolomeyev S.D. Inhibition of plasminogen/plasminogen activator system by angiostatin-like
plasminogen fragments is involved in mechanism of antiangiogenesis // J. Thromb. Haemost.,
2007, V. 5, Suppl. 2, P. 383.
16. Mukhametova L.I., Aisina R.B., Gulin D.A., Beznos O.V., Stoljarova E.P., Chesnokova N.B.
Fibrinolytic system components in rabbit tears after chemical burn of cornea // J. Thromb.
Haemost., 2007, V. 5, Suppl. 2, P. 407.
17. Чеснокова Н.Б., Никольская И.И., Мухаметова Л.И., Кост О.А., Айсина Р.Б., Безнос О.В.,
Столярова Е.П., Гулин Д.А., Биневский П.В. Взаимосвязь фибринолитической и ренинангиотензиновой систем глаза в норме и после ожога роговицы // VIII Ежегодная
международная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗЫ "Биохимическая физика",
Москва, 2008, С. 73.
18. Aisina R., Gulin D., Levashov M., Mukhametova L., Gershkovich K. and Varfolomeyev S.
Test-systems for estimating the biological activities of angiostatin-like plasminogen fragments
in vitro // J. Thromb. Haemost., 2008, V. 6, Suppl. 1, W1-01.
25
19. Mukhametova L., Gulin D., Aisina R., Kost O., Nikolskaya I., Beznos O. and Chesnokova N.
Activity of fibrinolytic system (FS) components and angiotensin converting enzyme (ACE) in
various tissues of rabbit eyes before and after cornea burn // J. Thromb. Haemost., 2008, V. 6,
Suppl. 1, P5-01.
20. Gulin D., Mukhametova L., Aisina R., Binevski P., Kost O., Nikolskaya I., Gershkovich K. and
Varfolomeyev S. Interference of the inhibitors of renin-angiotensin system (RAS) and
fibrinolytic system (FS) on their key enzymes in vitro // J. Thromb. Haemost., 2008, V. 6,
Suppl. 1, P5-02.
21. Безнос О.В., Никольская И.И., Чеснокова Н.Б., Столярова Е.П., Мухаметова Л.И.,
Биневский П.В., Гулин Д.А. Влияние ожоговой травмы роговицы на активность
компонентов локальных ренин-ангиотензиновой и фибринолитической систем в слезе и
водянистой
влаге
международным
у
кроликов
участием
//
Труды
«Российский
научно-практической
общенациональный
конференции
с
офтальмологический
форум», Москва, 2008, С. 133-136.
22. Гулин Д.А., Мухаметова Л.И., Айсина Р.Б., Гершкович К.Б. Кинетика активации
плазминогена рекомбинантной стафилокиназой (SakSTAR) в присутствии фраксипарина
// IV Всероссийская конференция по клинической гемостазиологии и гемореологии в
сердечно-сосудистой хирургии, Москва, 2009, С. 133.
23. Присяжная Н.В., Мухаметова Л.И., Гулин Д.А., Гершкович К.Б., Айсина Р.Б.
Ингибирующие эффекты ангиостатинов на активацию плазминогена под действием
эндогенных активаторов плазминогена. // IV Всероссийская конференция по клинической
гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии, Москва, 2009, С. 412413.
24. Gulin D.A., Mukhametova L.I., Beznos O.V., Prisyazhnaya N.V., Aisina R.B., Chesnokova
N.B., Varfolomeyev S.V. Activity of fibrinolytic system and inhibition of neovascularization by
angiostatin in rabbit eye inflammation model // International Conference “Biocatalysis-2009:
fundamentals & applications”, Arkhangelsk, 2009, Р. 125-126.
25. Aisina R., Mukhametova L., Prisyazhnaya N., Gulin D., Gershkovich K., Varfolomeyev S.
Mechanism of inhibitory action of angiostatin on plasminogen (Pg) activation by tissue
plasminogen activator (tPA) and urokinase (uPA) // J. Thromb. Haemost., 2009. V. 7, Suppl. 2,
PP-TH-227, P. 1010.
26. Mukhametova L., Gulin D., Aisina R., Beznos O., Chesnokova N., Nikolskaya N., Binevski P.,
Kost O. The effect of tranexamic acid and captopril on inflammatory process // J. Thromb.
Haemost., 2009, 7, Suppl. 2, PC-005, Р. 1172.
26