Экзаменационные вопросы по КБТ Лена 2. Методы биотехнологии: генная и хромосомная инженерия.
реклама
Экзаменационные вопросы по КБТ Лена 1. Краткая история и этапы развития клеточной биотехнологии. 2. Методы биотехнологии: генная и хромосомная инженерия. 3. Методы биотехнологии: клеточная и тканевая инженерия. 4. Методы биотехнологии: инженерная энзималогия и белковая инженерия. 5. Методы биотехнологии: криосохранение. 6. Отрасли биотехнологии: сельскохозяйственная бт. 7. Отрасли биотехнологии: промышленная бт. 8. Отрасли биотехнологии: медицинская и ветеринарная бт. 9. Отрасли биотехнологии: пищевая бт. 10. Отрасли биотехнологии: экологическая бт. Тумашбаева 11. Отрасли биотехнологии: биоэнергетика и биоэлектроника. Саша 12. Роль клеточной бт среди других областей бт. 13. Структурная, функциональная и сравнительная геномика. 14. Геномика и протеомика – молекулярные основы клеточной бт. 15. Объекты клеточной бт. 16. Клеточная инженерия растений (общая характеристика). Лена 17. Клеточная инженерия животных (общая характеристика). Мг 18. Соматическая гибридизация растений. 19. Многообразие получения соматических гибридов с различным сочетанием родительских ядерных и цитоплазматических геномов (ядерные гибриды, гетерокарион, цибриды, цитогеты и т.д.). Саша 20. Классификация антибиотиков. 21. Вакцины. Типы вакцин (общая характеристика). 22. Живые (цельномикробные, цельновирионные) и инактивированные вакцины. 23. Корпускулярные и генно-инженерные (векторные) вакцины. Мг 24. Генная инженерия растений. 25. Трансгенные животные. Получение и практическое применение. Саша 26. Клеточная реконструкция. Мг 27. Культура микроорганизмов (цели и задачи культивирования, способы и условия культивирования). 28. Культура клеток растений (цели и задачи культивирования, способы и условия культивирования). Лена 29. Культура клеток животных (цели и задачи культивирования, способы и условия культивирования). 30. Культура клеток низших растений (культура водорослей). Мг 31. Изобразите в виде схемы этапы технологии получения рекомбинантной ДНК. Лена 32. Культура клеток как модельный объект изучения действия на организм, ткани и органы различных биологически активных соединений, лекарственных средств, токсинов, патогенов и т.д. Мг 33. Использование культур клеток для лечения болезней. 34. Методы получения химерных животных (изобразите схему получения аллоферных мышей). 35. Изобразите в виде схемы этапы технологии получения гибридом. 36. Изобразите схематично этапы технологии получения моноклональных антител (МАТ). 37. Практические аспекты применения моноклональных антител. 38. Микробиологическое производство лекарственных средств. Саша 39. Технологии создания и производства антибиотиков (на примере промышленного производства гентамицин сульфата). 40. Использование в биотехнологии цианобактерий и микроводорослей. Мг 41. Изобразите схематично этапы технологии клонирования животных. 42. Изобразите схематично этапы технологии клонирования растений. Саша 43. Клонирование гена (ПЦР) и генная терапия. 44. Культура стволовых клеток. Применение в медицине. Мг 45. Способы получения иммобилизованных клеток и ферментов. Лена 46. Клеточная селекция. 47. Использование клеточных бт в медицине. 48. Использование клеточных бт в сельском хозяйстве. 49. Использование клеточных технологий в экологии. Тумашбаева 50. Безотходная технология производства биогаза. Лена 51. Методы клонирования растений. Мг 52. Технологии оздоровления растений: культура апикальных меристем. Балжан 53. Использование рекомбинантных микроорганизмов для получения коммерческих продуктов (ферментов, гормонов, витаминов и т.д.). Саша 54. Биодеградация токсичных соединений и утилизация биомассы. 55. Микробные инсектициды. Получение и применение. Мг 56. Векторные системы, применяемые в генетической инженерии. 57. Химический метод слияния протопластов. 58. Физический (электрический) метод слияния протопластов. 59. Получение и культивирование протопластов растений. Саша 60. Применение культуры клеток в производстве биологически активных веществ (БАВ). 1. Краткая история и этапы развития клеточной биотехнологии. 1)История развития биотехнологии За последние 20 лет биотехнология, благодаря своим специфическим преимуществам перед другими науками, совершила решительный прорыв на промышленный уровень, что в немалой степени обязано также развитию новых методов исследований и интенсификации процессов, открывших ранее неизвестные возможности в получении биопрепаратов, способов выделения, идентификации и очистки биологически активных веществ. Биотехнология формировалась и эволюционировала по мере формирования и развития человеческого общества. Ее возникновение, становление и развитие условно можно подразделить на 4 периода. 1. Эмпирический период или доисторический — самый длительный, охватывающий примерно 8000 лет, из которых более 6000 лег до н.э. и около 2000 лет ил. К эмпирическому периоду относятся получение кисломолочных продуктов, квашеной капусты, медовых алкогольных напитков, силосование кормов. Эмпиризм также был характерен и в практике использования полезных растений и животных. В 1796 г. произошло важнейшее событие в биологии - Э. Дженнером были проведены первые в истории прививки человеку коровьей оспы. 2. Этиологический период в развитии биотехнологии охватывает вторую половину XIX в. и первую треть XX в. (1856 - 1933 гг.). Он связан с выдающимися исследованиями великого французского ученого Л. Пастера (1822 - 95) - основоположника научной микробиологии. Пастер установил микробную природу брожения, доказал возможность жизни в бескислородных условиях, создал научные основы вакцинопрофилактики и др. В 1859 г. Л. Пастер приготовил жидкую питательную среду, Р. Кох в 1881 г. предложил метод культивирования бактерий на стерильных ломтиках картофеля и на агаризованных питательных средах В этот период было начато изготовление прессованных пищевых дрожжей, а также продуктов их метаболизма - ацетона, бутанола, лимонной и молочной кислот, во Франции приступили к созданию биоустановок для микробиологической очистки сточных вод. 3.Биотехнический период - начался в 1933 г. и длился до 1972 г. В 1933 г. А. Клюйвер и А.Х.Перкин опубликовали работу «Методы изучения обмена веществ у плесневых грибов . Началось внедрение в биотехнологию крупномасштабного герметизированного оборудования, обеспечивающего проведение процессов в стерильных условиях. Особенно мощный толчок в развитии промышленного биотехнологического оборудования был отмечен в период становления и развития производства антибиотиков (время второй мировой войны 1939-1945 гг., когда возникла острая необходимость в противомикробных препаратах для лечения больных с инфицированными ранами). 4. Геннотехнический период начался с 1972 г., когда П.Берг создал первую рекомбинацию молекулы ДНК, тем самым показав возможность направленных манипуляцией с генетическим материалом бактерий. Естественно, что без фундаментальной работы Ф. Крика и Дж. Уотсона по установлению структуры ДНК было бы невозможно достигнуть современных результатов в области биотехнологии. Выяснение механизмов функционирования и репликации ДНК, выделе-ние и изучение специфичных ферментов привело к формированию строго научного подхода к разработке биотехнических процессов на основе генноинженерных манипуляций. 2. Методы бт: генная и хромосомная инженерия. Ген. инженерия - получение новых комбинаций генетического материала путем проводимых вне клетки манипуляций с молекулами н к и переноса созданных конструкций генов в живой организм, в результате которого достигается их включение и активность в этом организме и у его потомства. Ген инженерия - система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторным путем (в пробирке) искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных или гибридных молекул ДНК. Методы генной инженерии позволяют провести генетическую паспортизацию, диагностировать генетические заболевания, создавать ДНК-вакцины, проводить генотерапию различных заболеваний. Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы: специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами; быстрое секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;конструирование рекомбинантной ДНК; гибридизация нуклеиновых кислот ; клонирование ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий; введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы. Хромосомная инженерия. В настоящий момент связывается прежде всего с возможностями замещения (замены) отдельных хромосом у растений или добавления новых. Известно, что в клетках каждого диплоидного организма имеются пары гомологичных хромосом. Такой организм называют дисомиком. Если в какой-либо паре хромосом остается одна гомологичная хромосома, то получается моносомик. При добавлении третьей гомологичной хромосомы возникает трисомик, а при отсутствии в геноме одной пары гомологичных хромосом возникает нуллисомик. Такие манипуляции с хромосомами дают возможность заменять одну или обе гомологичные хромосомы, допустим, одного сорта пшеницы на ту же пару хромосом, но из другого сорта. Что это дает селекционеру? Тем самым он может один признак, который ему кажется слабым у данного сорта , заменить на этот же, но более сильный признак из другого сорта. Другой методический прием состоит во введении (внедрении) в геном определенного вида или сорта какой-либо дополнительной пары хромосом другого вида растений, которые определяют развитие признака, отсутствующего у первого вида. 3. Методы бт: клеточная и тканевая инженерия. Кле-ная инженерия-метод конструирования нового типа кл-к на основе культ-ния, гибридизаций и реконструкций. При кле-ной гибридизаций искус-но объед. кл-ки с обр-ем гибридной кл-ки. Сущность этого способа гибридизации заключается в том, что в качестве родительских используют не половые клетки (гаметы), а клетки тела растения, из которых изолируют протопласты. При определенном воздействии (химический-в суспензию добавляютвещества, стимулирующие слияние-фюзогенов; физический-суспензий встраивают между двумя электродами(катодом и анодом)) протопласты заставляют сливаться друг с другом. Из полученных гибридных кл-к в дальнейшем регенерируют целые растения-гибриды. По сравнению с половой она имеет ряд преимуществ: возможность скрещивания филогенетически отдаленных видов растений, получение асимметричных гибридов, гибридов, гетерозиготных по внеядерным генам и др. Недостатком метода яв-ся невозможность управления процессом и вследствие этого непредсказуемость результатов. С помощью соматической гибридизации между культурными растениями и дикими видами были получены: сорта картофеля, устойчивые к вирусным заболеваниям, фитофторозу, колорадскому жуку; томаты, устойчивые к вирусу табачной мозаики. Из гибридной раст-й кл-ки на специальной среде можно вырастить клеточную массу – каллюс, дифференцирующуюся в нормальное целое растение с корнями, стеблями и т. д. Другое направление клеточной инженерии –клеточная реконструкция-создание жизнеспособной клетки из отдельных фрагментов разных клеток(органеллыядро,митохондрий). Основой служит протопласты растений и эмбриональные и стволовые клетки для животных.Используют для получения ассиметричных гибридов,моноклональных антител. Тканевая инженерия— создание новых тканей и органов для терапевтической реконструкции поврежденного органа посредством доставки в нужную область опорных структур, клеток, молекулярных и механических сигналов для регенерации. Целью тканевой инженерии является восстановление биологических (метаболических) функций, т. е. регенерация ткани, а не простое замещение ее синтетическим материалом. Создание тканеинженерного имплантата включает несколько этапов: отбор и культивирование собственного или донорского клеточного материала; разработка специального носителя для клеток (матрицы) на основе биосовместимых материалов; нанесение культуры клеток на матрицу и размножение клеток в биореакторе со специальными условиями культивирования;непосредственное внедрение импланта в область пораженного органа или предварительное размещение в области, хорошо снабжаемой кровью, для дозревания и формирования микроциркуляции внутри импланта . Клеточный материал может быть представлен клетками регенерируемой ткани или стволовыми клетками. Для создания матриц применяют биологически инертные синтетические материалы, материалы на основе природных полимеров (хитозан, альгинат, коллаген). 4. Методы биотехнологии: инженерная энзималогия и белковая инженерия. В конце 60-х – начале 70-х гг. на базе технической биохимии, химической технологии, химической энзимологии и ряда инженерных дисциплин возникло новое научнотехническое направление биотехнологии – инженерная энзимология, к которой относят систему методов получения, очистки, стабилизации и применения ферментов. Основной задачей инженерной энзимологии является конструирование биоорганических катализаторов с заданными свойствами на основе ферментов или ферментных комплексов и разработка на их базе различных эффективных и экологически чистых биотехнологических процессов. Высокая субстратная специфичность ферментативного катализа и уникальная способность ускорять реакции позволяют получать высокие выходы продуктов и создавать практически безотходные биотехнологические процессы, не загрязняющие окружающую среду. Эффективные биотехнологические процессы на основе ферментативного катализа используются все шире в различных сферах человеческой деятельности: пищевой промышленности, энергетике, медицине, биоэлектрокатализе и микроэлектронике. Белковая инженерия. Преимущества иммобилизованных ферментов: гетерогенный катализ-р легко отделяется от реакционной среды,что позволяет остановить реакцию в любой момент, процессы с использованием иммобилизованных фрементов можно проводить непрерывно, модификация фермента изменяет свойства:специфичность, зависимость каталитической активности от рН, можно регулировать каталитическую активность иммоб-х ферментов путем изменеия свойств носителя действием факторов: свет, температура, ультрозвук. Разработка методов направленного мутагенеза дала возможность не только с высокой точностью модифицировать отдельные белки и изучать их структурно-функциональные взаимоотношения, но и конструировать новые белки, не существовавшие в природе, путем объединения фрагментов и функциональных доменов разных полипептидных цепей с использованием генно-инженерных методов. Другое перспективное направление белковой инженерии - это конструирование биологически активных пептидов, обладающих фармакологической активностью. 5. Методы биотехнологии: криосохранение. Криоконсервация- это длительное хранение биологических объектов в жизнеспособном состояний путем их глубокого замораживания и последующего хранения в жидком азоте(196 0С) или в его парах (-150 0С). Этим методом хранятся цианобактерий, пурпурные и зеленые водоросли, мицелиальные грибы, актиномицеты, растительные и животные клетки, генетически модифицированные клетки. Процесс криоконсервации включает следующие этапы:1,подготовка культуры клеток;2.Внесение криопротектора;3.программное замораживание и хранение в жидком азоте; 4.быстрое оттаивание5.удаление криопротектора.6.Рекультивирование микроорганизмов. Этап подготовки культуры- это культивирование на питательных средах, содержащих различные осмотически активные вещества(маннит или сорбит, аминокислоты( чаще используют пролин-хорошо связывает воду в клетках). Успех низкотемпературной крионсервации зависит от ряда факторов: вид и тип клеток, их концентрация в суспензии, состав среды для консервирования, вид и концентрация криопротектора, режим охлаждения и отогрева, способ реабилитации клеток после отогрева. Существенную роль в успешном замораживании клеток играет их морфофизиологическое состояние: клетки, находящиеся в стационарной фазе роста, менее устойчивы к повреждающему действию низкотемпературной консервации, чем клетки, находящиеся в экспоненциальной фазе роста. Клетки для замораживания отбирают в середине экспоненциальной фазы ростовой кривой. Программы охлаждения могут быть различными, но для всех них характерна медленная скорость охлаждения. При медленном охлаждении происходит образование внеклеточного льда, приводящее к обезвоживанию клетки до того, как будет достигнута точка замерзания цитоплазмы. При быстром охлаждении клетки быстрее замораживаются изнутри, медленнее обезвоживаются, что приводит к образованию кристаллов льда внутри клетки. Чтобы оживить замороженные культуры, их быстро оттаивают в водяной бане при 37 °С и слабом встряхивании, пока не растает весь лед. Сразу же после оттаивания ампулу извлекают из водяной бани и дезинфицируют ее. Ампулу вскрывают и в стерильных условиях переносят культуру в свежую среду. Далее клетки проверяют на жизнеспособность с помощью витальных красителей, окрашивающих мертвые клетки. Криопротекторывещества, которые снижают точку замерзания, связывет внутриклеточную воду и защищают клетку от механического и осмотического стресса. При хранении бактерий в жидком азоте применяют криопротекторы двух типов: К первому относятся глицерин и диметилсульфоксид (ДМС), которые легко проходят через клеточную мембрану и обеспечивают как внутриклеточную, так и внеклеточную защиту от замораживания. Ко второму виду криопротекторов относятся такие вещества, как сахароза, лактоза, глюкоза, маннит, сорбит, декстран, поливинилпирролидон и полигликоль, которые обеспечивают защитное действие на наружной поверхности клеточной мембраны. Недостатком является возможная потеря микробных клеток в процессе заморозки и разморозки - не все клетки сохраняют жизнеспособность => снижается эффективность криоконсерваций. 6. Отрасли бт: сельскохозяйственная бт. Это направление охватывает растениеводство,животноводство и ветеринарию. Создание сельскохоз-х культур,сбалансированных по содержанию белка, углеводов,жиров, минеральных элементов на основе достижения клеточной бт и тотипотентности растительных клеток,клональном микроразмножений и ускоренном получений линий сельскохоз-х растений, используемых в селекций на устойчивость,продуктивность и качество; оздоровление растений от вирусов; получение БАВ и кормовых белков растительного происхождения; сохранение ценных генотипов; использование изолированных клеток,генно-инженерных технологий в селекций растений,дающих сорта и линий, устойчивые к засухе,низким температурам; разработка генетичкских основ повышения эффективности использования азотфиксирующих микроорганизмов,клубеньковых микроорганизмов. В животноводстве применение клеточной биотехнологии, трансплантации эмбрионов позволяет улучшать хозяйственно- ценные свойства: рост и упитанность, устойчивость к инфекции, высокие удои молока; путем рекомбинатной ДНК - технологии получают бав с молоком трансгённых животных (человеческий сывороточный альбумин, антигемофяльный фактор, антитрипсин, урокиназа, химозин и др.); столь же актуально получение кормовых белков, незаменимых аминокислот, витаминов, антибиотиков, пополняющих рацион сельскохозяйственных животных. Актуальна задача уменьшения применения в сельском хозяйстве средств химизации, пестицидов и расширение использования бактериальных удобрений, инсектицидов мик-робного происхождения; разработка генно-инженерных вакцин и диагностикумов на основе моноклональных антител. 7. Отрасли бт: промышленная бт. Охватывает различные отрасти народного хоз-ва. Ведущим звеном промышленной бт яв-ся промышленная микробиология. Это получение в промышленных масштабах ферментов,антибиотиков, аминокислот микробного происхождения, производство в качестве инсектицидов и удобрений микробной биомассы,производ-во кормового белка,этанола, витаминов,органических кислот,полисахаридов,гормонов, БАВ на основе технологий рекомбинантных ДНК.С помощью микроорганизмов проводят биотрансформацию одних органических соединений в другие (например, сорбита во фруктозу). Промышленная бт имеет место в горной металлургий. Это биогеотехнология металлов,позволяющая извлекать с помощью микроорганизмов и их ферментов металлы в растворимой форме из минеральных концентратов,руды. К примеру,путем превращения сульфидов металлов в растворимые сульфиты. В нефтедобывающей отрасли находят применене микроорганизмы,расщепляющие балластный углеводород-парафин,разжижающие нефть,и облегчающие ее извлечение. Микроорганизмы-нефтедекструкторы используются для очистки загрязненных нефтепродуктами почв и водоемов. Получение биогаза из твердых отходов также имеет перспективы развития. Самостоятельное направление бт занимает в пищевой и легкой промышленности: хлебопечение,сыроделие,пивоварение,изготовление соков и вин, выделение кожи. Биоэлектроника-использование биосистем в качестве сенсоров,измерительноконтролирующих датчиков в сфере информационных технологий. Инженерная энзимологияполучение и использование ферментов в биотехнологий. Протоинженерия-технологий изменения свойств белков на генетическом уровне,получение новых белков. 8. Отрасли биотехнологии: медицинская и ветеринарная бт. Одно из основных периодов историй развития биотехнологий-это период открытия антибиотиков, их получение. Медицинская Бт – производство фармацевтических препаратов и диагностика заболеваний. Производство антибиотиков, противоопухолевых лекарств, витаминов, аминокислот, БАД, вакцины моноантитела.Расширяется производство и использование фитопрепаратов(алколоиды,гликозиды,стероиды, эфирные масла), ферментов микробного происхождения,полидекстранов. Антибиотики — самый большой класс фармацевтических соединений, синтез которых осуществляется микробными клетками. Ветеринарная Биотехнология обеспечивает принципиально новые подходы к улучшению здоровья животных и продуктивности скота и домашней птицы. Это улучшение возможно за счет усовершенствования диагностики, лечения и профилактики заболеваний; использования высококачественных кормов, производимых из трансгенных сортов кормовых растений; а также за счет повышения эффективности выведения новых пород. Современная ветеринарная промышленность обладает огромным набором средств для профилактики и лечения заболеваний, потенциально способных вызвать эпизоотию и гибель сельскохозяйственного поголовья. Своевременная диагностика и лечение в комбинации с активными профилактическими мерами способствует снижению затрат на производство продуктов питания, а также улучшению состояния здоровья животных в целом и, соответственно, повышению безопасности пищевых продуктов. Кроме диагностических тестов, вакцин и лекарственных препаратов, использующихся для поддержания здоровья сельскохозяйственных животных, биотехнология играет все более важную роль в выведении новых пород. Методы генетического картирования позволяют выявлять генетически устойчивых к различным заболеваниям животных и использовать их в селекционных проектах для получения здорового устойчивого к болезням потомства. 9. Отрасли биотехнологии: пищевая бт. Пищевая биотехнология - современное и перспективное направление в пищевой промышленности, использующее биотехнологические процессы для получения пищевых продуктов и различных форм пищи. Пища должна быть разнообразной и содержать белки, жиры, углеводы и витамины. Источники энергии — жиры и углеводы в определенных пределах взаимозаменяемы, причем их можно заменить и белками, но белки нельзя заменить ничем. Проблема питания людей в конечном счете заключается в дефиците белка. Наибольшую популярность как источники белка приобрели семена масличных культур :сои, семян подсолнечника, арахиса и других, которые содержат до 30 процентов высококачественного белка. По содержанию некоторых незаменимых аминокислот он приближается к белку рыбы и куриных яиц и перекрывает белок пшеницы. Применяя обычные технологические линии по производству синтетических волокон, можно получать из искусственных белков длинные нити, которые после пропитки их формообразующимн веществами, придания им соответствующего вкуса, цвета и запаха могут имитировать любой белковый продукт. Таким способом уже получены искусственное мясо (говядина, свинина, различные виды птиц), молоко, сыры и другие продукты. В состав такого мяса обязательно включают специально обработанный искусственный белок, небольшое количество яичного альбумина, жиры, витамины, минеральные соли, природные красители, ароматизаторы и прочее, что дает возможность «лепить» изделие с заданными свойствами, учитывая при этом физиологические особенности организма, для которого продукт предназначен. Это особенно важно в диете детей и людей пожилого возраста, больных и выздоравливающих, когда необходимо лимитировать питание по целому ряду пищевых компонентов, что весьма трудно сделать, используя традиционные продукты. Спектр продуктов питания, получаемых при помощи микроорганизмов, обширен. Это продукты, получаемые в результате брожения - хлеб, сыр, вино, пиво, творог и так далее. До недавнего времени биотехнология использовалась в пищевой промышленности с целью усовершенствования освоенных процессов и более умелого использования микроорганизмов, но будущее здесь принадлежит генетическим исследованиям по созданию более продуктивных штаммов для конкретных нужд, внедрению новых методов в технологии брожения. Получение молочных продуктов в пищевой промышленности построено на процессах ферментации. Основой биотехнологии молочных продуктов является молоко. В сквашивании молока обычно принимают участие стрептококки и молочнокислые бактерии. Путем использования реакций, которые сопутствуют главному процессу сбраживания лактозы получают и другие продукты переработки молока: сметану, йогурт, сыр и т.д. С использованием микроорганизмов выпускают кефир, сметану, творог, простокваши, казеин, сыры, биофруктолакт, биолакт, с использованием ферментов пищевой гидролизат казеина, сухую молочную смесь для коктейлей и т.д. При внесении микроорганизмов в молоко лактоза гидролизуется до глюкозы и галактозы, глюкоза превращается в молочную кислоту, кислотность молока повышается, и при рН 4-6 казеин коагулирует. Производство сыра, или сыроделие (сыроварение) - один из древнейших процессов, основанных на ферментации. На первом этапе идет подготовка молока (первичная обработка). На втором - готовится культура молочнокислых бактерий. Микроорганизмы подбираются в определенной пропорции, обеспечивающей наилучшее качество. Набор бактерий также зависит от температуры термообработки. Третья стадия стадия ферментации, - в сыроварении в некоторых случаях происходит в 2 этапа, до и после стадии выделения. Сначала молоко инокулируют определенными штаммами микроорганизмов, приводящими к образованию молочной кислоты, а также добавляют сычужный фермент реннин. Реннин ускоряет превращение жидкого молока в сгусток (створаживание) в несколько раз. Эта реакция активируется молочной кислотой, вырабатываемой бактериями. 10. Отрасли биотехнологии: экологическая бт. -это научно-техническое направление,включающее применение биотехнологии для решения проблем окружающей среды (обработка сточных вод, переработка твердых отходов, борьба с загрязнениями окружающей среды и др.) Экологическая биотехнология — это специальное применение биосистем и процессов для решения задач охраны окружающей среды и рационального природопользования. Эти процессы включают утилизацию сельскохозяйственных, бытовых и промышленных отходов, очистку стоков и газо-воздушных выбросов, деградацию ксенобиотиков, получение эффективных и нетоксичных препаратов для борьбы с болезнями и вредителями культурных растений и домашних животных, а также создание альтернативных и безвредных для окружающей среды способов воепроизводства пищи, лекарственных препаратов, энергоносителей и добычи полезных ископаемых. Промышленные экосистемы, формирующиеся на территории промышленных комплексов и городов, характеризуются следующими особенностями: высоким уровнем загрязненности (физические, химические и биологические загрязнения), высокой зависимостью от внешних источников энергии, неблагоприятным влиянием на смежные экосистемы. Решение проблем окружающей среды, возникающих в антропогенных экосистемах, таких как переработка отходов, очистка воды, устранение загрязнений, составляет предмет экологической биотехнологии. В настоящее время выделен ряд микроорганизмов, способных к деградации ксенобиотиков (неприродных, синтетических химических веществ) – гербицидов, пестицидов, хладагентов, растворителей. Однако широкое применение биодеградации (разрушения загрязняющих веществ с помощью микроорганизмов) в большинстве случаев ограничено, так как: ни один из природных микроорганизмов не может разрушать все органические соединения; некоторые органические соединения в высокой концентрации подавляют функционирование или рост деградирующих их микроорганизмов; большинство очагов загрязнения содержит смесь химикатов, и микроорганизм, способный разрушить один или несколько ее компонентов, может инактивироваться другими компонентами; биодеградация органических соединений часто происходит достаточно медленно. Часть этих проблем решают биотехнологии, создавая с помощью генетических манипуляций рекомбинантные микроорганизмы, способные к деградации нескольких соединений. Отличие новых нанобиотехнологий от традиционных заключается в том, что наночастицы являются универсальным реагентом, способным нейтрализовать большое количество вредных веществ. Нейтрализация происходит в результате окисления железа в грунтовых водах и образования нерастворимых комплексов с такими токсичными веществами, как соединения свинца, никеля, ртути и даже тяжелых радиоактивных элементов. 11. Отрасли биотехнологии: биоэнергетика и биоэлектроника. Биоэнергетика- отрасль в биотехнологии связана с получением возобновляемых источников энергии: создание биогаз (биоэтанол, углеводород). Для сухого вещества простейший способ превращения биомассы в энергию заключается в сгорании - оно обеспечивает тепло, которое в свою очередь превращается в механическую или электрическую энергию. Что же касается сырого вещества, то в этом случае древнейшим и наиболее эффективным методом превращения биомассы в энергию является получение биогаза (метана). Метановое «брожение», или биометаногенез, - давно известный процесс превращения биомассы в энергию. Биогаз, получающийся в ходе этого процесса, представляет собой смесь из 65% метана, 30% углекислого газа, 1% сероводорода (Н 2S) и незначительных количеств азота, кислорода, водорода и закиси углерода. Производство биогаза имеет следующие достоинства: это источник энергии; отходы процесса служат высококачественными удобрениями. Биотехнология в состоянии внести крупный вклад в решение проблем энергетики посредством производства достаточно дешевого биосинтетического этанола, который кроме того является и важным сырьем для микробиологической промышленности при получении пищевых и кормовых белков, а также белково-липидных кормовых препаратов. Источником углеводородов также могут служить водоросли. У широко распространенной зеленой водоросли Botryococcus braunii (обитающей в пресной и солоноватой воде умеренных и тропических зон) углеводороды в зависимости от условий роста и разновидностей могут составлять до 75% сухой массы. Они накапливаются внутри клеток, и водоросли, в которых их много, плавают на поверхности. После сбора водорослей эти углеводороды легко отделить экстракцией каким-нибудь растворителем или методом деструктивной отгонки. Таким путем может быть получено вещество, аналогичное дизельному топливу и керосину. Биоэлектроника: В области электроники биотехнология может быть использована для создания улучшенных типов биосенсоров и новых приводящих устройств, называемых биочипы. Биотехнология делает возможным создание устройств, в которых белки являются основой молекул, действующих как полупроводники. Для индикации загрязнений различного происхождения в последнее время стали использовать не химические реагенты, а биосенсоры – ферментные электроды, а также иммобилизованные клетки микроорганизмов. Ферменты обладают высочайшей чувствительностью. Биоселективные датчики создают также путем нанесения на поверхность ионоселективных электродов целых клеток микроорганизмов или тканей. Например, Neurospora europea – для определения NH3, Trichosporon brassiacae – для определения уксусной кислоты. В качестве сенсоров используют также моноклональные антитела, обладающие исключительно высокой избирательностью. Лидерами в производстве биодатчиков и биочипов являются японские компании, такие как Hitachi, Sharp. Компания Sharp проводит исследования по разработке компьютеров с биокомпонентами. Появляется новый тип полупроводников, проводящую функцию в которых осуществляют молекулы белков. Такие ферментные системы работают с большей скоростью, чем кремниевые полупроводники. Биочипы имеют небольшие размеры, надежны и способны к самосборке. 12. Роль клеточной бт среди других областей бт. Клеточная биотехнология базируется на использовании культуры клеток, тканей и протопластов. Для того чтобы манипулировать клетками, нужно выделить их из растения и создать такие условия, при которых они могли бы жить и размножаться вне растительного организма. Метод культивирования изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) получил название культуры изолированных тканей и приобрёл особое значение в связи с возможностью его использования в биотехнологии. Культура клеток высших растений может рассматриваться с трёх точек зрения – как уникальная биологическая система, как модель в физиологии растений и как инструмент для разнообразных исследований и биотехнологий. Изолированные растительные клетки способны продуцировать ценные для медицины, парфюмерии и других отраслей промышленности вещества вторичного синтеза: алкалоиды, стероиды, гликозиды, гормоны, эфирные масла и т.д. Продуктивность культивируемых клеток в результате клеточной селекции может значительно превышать продуктивность целых растений. Использование изолированных культур клеток в селекции, дают возможность получать быстрорастущие растения, устойчивые к различным неблагоприятным факторам среды. Вместе с тем, это направление предусматривает создание новых растений путём слияния изолированных протопластов и получение соматических гибридов. Перенос в изолированные протопласты чужеродных генов с помощью методов генной инженерии позволяет получать в дальнейшем растения с новыми наследуемыми свойствами. Можно выделить две принципиальные особенности культуры клеток растений как биологической системы: во-первых, отсутствие организменного контроля развития, и вовторых - избыточный генетический материал. Культивируемые клетки и ткани могут служить адекватными моделями для исследований различных направленностей, например метаболизма и его регуляции в клетках и тканях целого растения.Культура клеток растений: производство БАВ и лекарств,белка,ферментов,получение биотопливо, получение новых сортов растений и расширение ген.разнообразия флоры, размножение редких видов растений. Культура клеток животных: произ-во лекарств,Бав(витамины,медиаторы,гормоны),получение новых форм и пород животных, расширение ген.разнообразия фауны,использование как модельных объектов для изучения физиологических,генетических процессов. 13. Структурная, функциональная и сравнительная геномика. Геномика это направление биологии исследующее генетический код в широком смысле: структурная геномика - последовательность нуклеотидов, наличия их модификаций, взаимодействий с белками, функциональная геномика - реалиация генетической информации, систематическая геномика использование последовательностей специфических участков ДНК для уточнения систематического положения живых организмов. Предмет этой науки - строение геномов человека и других живых существ (растений, животных, микроорганизмов и др.). Структурная геномика. Стремится описать трехмерную структуру каждого белка, закодированного данным геномом. Используется комбинация экспериментальных и моделирующих подходов. Структурная геномика использует законченные последовательности генома несколькими способами, чтобы определить структуры белка. Последовательность генов целевого белка может сравниваться с известной последовательностью, и структурная информация может тогда быть выведена из структуры известного белка. Структурная геномика может использовать основанный на моделировании подход, который полагается на соответствие между неизвестным белком и решенной структурой белка. Функциональная геномика.Главная задача функциональной геномики выяснение биологических функций генных продуктов (РНК и белков). Функциональная геномика стремится сначала предсказать функцию тех или иных биополимеров с помощью компьютерного анализа, и только затем переходит к экспериментальной проверке в пробирке предсказанной функции Сравнительная геномика. Сравнительные исследования содержания и организации геномов разных организмов. Позволяет по известным функциям генов мухи или червя-нематоды предсказывать функции генов человека. По известным функциям белков проводят реконструкцию обмена веществ. 14. Геномика и протеомика – молекулярные основы клеточной бт. Комплексное изучение структуры и функции генома привело к формированию геномики. Предмет этой науки - строение геномов человека и других живых существ (растений, животных, микроорганизмов и др.). Геномика это направление биологии исследующее генетический код в широком смысле: структурная геномика - последовательность нуклеотидов, наличия их модификаций, взаимодействий с белками, функциональная геномика - реализация генетической информации, систематическая геномика использование последовательностей специфических участков ДНК для уточнения систематического положения живых организмов. Сравнительная геномика. Сравнительные исследования содержания и организации геномов разных организмов. Позволяет по известным функциям генов мухи или червя-нематоды предсказывать функции генов человека. По известным функциям белков проводят реконструкцию обмена веществ. Развитие молекулярной биологии и генетики , появление технологий рекомбинантных ДНК дали возможность исследования изучений молекулярных механизмов болезней, разработки новых молекулярных методов диагностики, терапии и профилактики различных заболеваний. Итогом этих исследований явился проект «Геном человека». Цель проекта заключалась в секвенировании всего человеческого генома. Расшифровка генома, состоящего из 3 х 109 п.н. и содержащего 20-28 тыс. генов. Знание полной нуклеотидной последовательности генома человека позволит создавать более точные генетические карты и ускорит идентификацию генов, которые были локализованы путем анализа сцепления с конкретным маркером. Важнейший элемент геномных исследований — характеристика различных генов, составляющих эти геномы, изучение механизмов их регуляции, взаимодействия друг с другом и с факторами среды в норме и при патологии. Охарактеризовать таким образом как можно большее количество генов - основная задача функциональной геномики. Анализ любого генома включает определение нуклеотидной последовательности, белковых продуктов генов, изучение взаимодействия разных генов и белков и механизма регуляции всей системы. После расшифровки генома усилия исследователей фокусируются на изучении белковых продуктов генов. Этим занимается протеомика. Ее задача — определить все белки, синтезируемые в клетке, выяснить их строение, количество, локализацию, модификацию и механизмы взаимодействия. Протеомика — наука, основным предметом изучения которой являются белки и их взаимодействия в живых организмах, в том числе — в человеческом. Учёные, работающие в области протеомики, исследуют «производство» белков, их декомпозицию и замену белков внутри тела. Они также изучают как белки модифицируются после их синтеза в организме. Протеом — термин для обозначения совокупности белков (протеинов) организма. Любые молекулярно-биологические процессы, происходящие в живых организмах, отражаются в протеоме. Протеом организма — величина не постоянная, поскольку экспрессия генов может меняться под воздействием множества факторов внешней среды, а также изменений внутри организма, связанных, например, с возрастом, болезнью или другими причинами. Количество генов человека — около сорока тысяч; количество синтезируемых организмом человека белков — около полумиллиона. Многие из этих белков могут взаимодействовать друг с другом, а также влиять на синтез других белков. Изучение протеома организмов — задача чрезвычайно сложная, требующая кооперации усилий многих ученых и исследовательских центров. 15. Объекты клеточной бт. Биотехнологические объекты находятся на разных ступенях организации: а) субклеточные структуры (вирусы, плазмиды, ДНК митохондрий и хлоропластов, ядерная ДНК); б) бактерии и цианобактерии; в) грибы; г) водоросли; д) простейшие; е) культуры клеток растений и животных; ж) растения – низшие (анабена-азолла) и высшие. Бактерии используются при производстве: пищевых продуктов, например, уксуса молочнокислых напитков и др.; - микробных инсектицидов; - белка; - витаминов; - растворителей и органических кислот; - биогаза и фотоводорода. Полезные бактерии относятся к эубактериям. Уксуснокислые бактерии это грамотрицательные бактерии, превращающие этанол в уксусную кислоту, а уксусную кислоту в углекислый газ и воду. Анаэробные, образующие споры бактерии сбраживают сахара в ацетон, этанол, изопропанол и n-бутанол. Молочнокислые бактерии не образуют спор, грамположительны и нечувствительны к кислороду. Гетероферментативные молочнокислые бактерии превращают углеводы в молочную кислоту, этанол и углекислый газ. Гомоферментативные продуцируют только молочную кислоту, а брожение позволяет получить наряду с молочной кислотой ряд разнообразных продуктов. Бактерии используются для микробного выщелачивания руд и утилизации горнорудных отходов. Широко используется такое свойство некоторых бактерий, как диазотрофность, т.е. способность к фиксации атмосферного азота. Выделяют 2 группы диазотрофов: симбионты: без корневых клубеньков (азотобактер - лишайники), с корневым клубеньками (бобовые – ризобии, облепиха – актиномицеты); свободноживущие: гетеротрофы (азотобактер, клостридиум), автотрофы (хлоробиум, родоспириллум). Бактерии также широко используются в генноинженерных манипуляциях при создании геномных клонотек, введении генов в растительные клетки (агробактерии). Грибы. Грибы используют для получения таких продуктов, как: 1) антибиотики (пенициллы, стрептомицеты, цефалоспорины); 2) гиббереллины и цитокинины (физариум и ботритис); 3) каротиноиды (н-р, астаксантин, придающий мякоти лососевых рыб красно-оранжевый оттенок вырабатывают Rhaffia rhodozima, которых добавляют в корм на рыбозаводах); 4) белок (Candida, Saccharomyces lipolitica); 5) сыры типа рокфор и камамбер (пенициллы); 6) соевый соус (Aspergillus oryzae). Простейшие относятся к числу нетрадиционных объектов биотехнологии. Они используются как компонент активного ила при биологической очистке сточных вод. Так же как продуценты биологически активных веществ. Экологическую нишу занимают простейшие, обитающие в рубце жвачных животных. Они обладают ферментом целлюлазой, способствующей разложению клетчатки в желудке жвачных. Простейшие рубца могут быть источником этого ценного фермента. Водоросли. Водоросли используются для получения белка. Перспективны в этом отношении культуры рода Chlorella и Scenedesmus. Их биомасса после соответствующей обработки используется в качестве добавки в рационы скота, а также в пищевых целях. Водоросли — единственный источник получения агара, агароидов, каррагинина, альгинатов. Основным источником агара служит красная водоросль анфельция. Бурые водоросли являются единственным источником получения солей альгиновой кислоты, альгинатов. Альгинаты широко применяются в народном хозяйстве. Это изготовление смазок для трущихся деталей машин, медицинские и парфюмерные мази и кремы, синтетические волокна и пластики, стойкие к любой погоде лакокрасочные покрытия, не выцветающие со временем ткани, производство шелка, строительных материалов, пищевые продукты отличного качества — фруктовые соки, консервы, мороженое, стабилизаторы растворов, брикетирование топлива, литейное производство и др. Культура клеток растений: производство БАВ и лекарств,белка,ферментов,получение биотопливо, получение новых сортов растений и расширение ген.разнообразия флоры, размножение редких видов растений. Культура клеток животных: произ-во лекарств,Бав(витамины,медиаторы,гормоны),получение новых форм и пород животных, расширение ген.разнообразия фауны,использование как модельных объектов для изучения физиологических,генетических процессов. 16. Клеточная инженерия растений (общая характеристика). Клеточная инженерия-метод конструирования клеток нового типа на основе их культивирования,гибридизаций и реконструкций.При гибридизаций искусственно объединяют клетки с образованием гибридного генома. Сущность этого способа гибридизаций заключается в том,что в качестве родительских форм используют не половые а соматические клетки,из которых изолируют протопласты. Из полученных гибридных клеток потом регенирирует целое растение. Клеточная реконструкция-создание жизнеспособной клетки из отдельных фрагментов разных клеток(ядра,цитоплазмы,митохондрий,хромосом..)В рез-те таких манипуляций могут быть созданы клетки с необычными сочетаниями ядерных и цитоплазматических генов. Протопласт яв-ся идеальным реципиентом для чужеродной ДНК,которая часто пред-т собой плазмиды. Выделение ,культивирование, слияние протопласто и перенос в них клеточных органиелл,отдельных хромосом, ДНК позволит генетикам расширить разнообразие получаемых гибридных растений. Клеточная инженерия у растений заключается в получении растений из одной клетки, а также в генетических манипуляциях с изолированными клетками, направленными на преобразование их генотипов. Метод получения растений из одной клетки основан на способности тканей растений ряда видов к неорганическому росту на специальных искусственных средах, содержащих питательные вещества и регуляторы роста. При культивировании тканей растений на таких средах многие клетки оказываются способными к неограниченному размножению, образуя слои (массу) недифференцированных клеток, получивших название каллуса. Если затем каллус разделить на отдельные клетки и продолжить культивирование изолированных клеток на питательных средах, то из отдельных клеток могут развиться настоящие растения. Способность одиночных соматических клеток растений развиваться в настоящее (целое) растение, называют тотипотентностью. Получение растений из одной клетки или протопласта называют клональным микроразмножением. Преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет резко сократить сроки размножения многих видов растений, а также очень быстро воспроизвести одно и то же растение в сотнях тысяч экземпляров, что имеет исключительно важное значение в селекционной работе и в получении посадочного материала, незараженного возбудителями болезней. Соматическую гибридизацию осуществляют в несколько этапов: 1. Получение и слияние протопластов, происходящих от клеток растений разных видов. 2. Культивирование гибридных протопластов, используя селективные питательные среды. 3. Регенерация растений из соматических гибридов (гибридов протопластов) через образование последними каллуса. Для удаления клеточной стенки используют ферменты трех типов: пектиназы, целюллазы, гемицеллюлазы. 17. Клеточная инженерия животных (общая характеристика). КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ, совокупность методов, используемых для конструирования новых клеток. Включает культивирование и клонирование клеток на специально подобранных средах, гибридизацию клеток, пересадку клеточных ядер и другие микрохирургические операции по «разборке» и «сборке» (реконструкции) жизнеспособных клеток из отдельных фрагментов. Соматическую гибридизацию, т. е. получение гибридов без участия полового процесса, проводят, культивируя совместно клетки различных линий одного вида или клетки различных видов. При определённых условиях происходит слияние двух разных клеток в одну гибридную, содержащую оба генома объединившихся клеток. Удалось получить гибриды между клетками животных, далёких по систематическому положению, напр. мыши и курицы. С помощью гибридных клеток, полученных от клеток человека и мыши и человека и китайского хомячка, была проделана важная для медицины работа по картированию генов в хромосомах человека. Гибриды между опухолевыми клетками и нормальными клетками иммунной системы (лимфоцитами) – т. н. гибридомы – обладают свойствами обеих родительских клеточных линий. Подобно раковым клеткам, они способны неограниченно долго делиться на искусственных питательных средах (т. е. они «бессмертны») и, подобно лимфоцитам, могут вырабатывать моноклональные (однородные) антитела определённой специфичности. Такие антитела применяют в лечебных и диагностических целях, в качестве чувствительных реагентов на различные органические вещества и т. п. Другое направление клеточной инженерии – манипуляции с безъядерными клетками, свободными ядрами и другими фрагментами, сводящиеся к комбинированию разнородных частей клетки. Путём соединения клеток разных зародышей на ранних стадиях их развития выращивают мозаичных животных, или химер, состоящих из двух различающихся генотипами видов клеток. С помощью таких экспериментов изучают процессы дифференцировки клеток и тканей в ходе развития организма. Ведущиеся уже не одно десятилетие опыты по пересадке ядер соматических клеток в лишённые ядра (энуклеированные) яйцеклетки животных с последующим выращиванием зародыша во взрослый организм с кон. 20 в. получили широкую известность как клонирование животных. Преимущество клеточной инженерии в том, что она позволяет экспериментировать с клетками, а не с целыми организмами. Последнее гораздо сложнее, а иногда и невозможно, особенно в случае млекопитающих животных и человека или при получении отдалённых гибридов. Методы клеточной инженерии в медицине, сельском хозяйстве или биотехнологии часто применяют в сочетании с генной инженерией. Более сложный способ получения трансгенных животных разработан на мышах, различающихся по окраске шерстного покрова и сводится к следующему. Вначале из организма беременной серой мыши извлекают четырехдневных зародышей и измельчают их на отдельные клетки. Затем из эмбриональных клеток извлекают ядра, переносят их в яйцеклетки черных мышей, предварительно лишенные ядер. Яйцеклетки черных мышей, содержащие чужие ядра, помещают в пробирки с питательным раствором для дальнейшего развития. Развившиеся из яйцеклетки черных мышей зародыши имплантируют в матки белых мышей. В выполненных по этой методике экспериментах от пяти белых мышей ("приемных матерей") было получено 36 мышей, среди которых трое были серыми. 18. Соматическая гибридизация растений. Под соматической гибридизацией понимается гибридизация между протопластами, выделенными из соматических клеток растений. Для соматической гибридизации используют протопласты, полученные из мезофильных клеток листа или каллусных тканей. Слияние протопластов - своеобразный метод гибридизации, парасексуальная, или соматическая. При гибридизации искусственно объединяют клетки с образованием гибридного генома. Сущность этого способа гибридизации заключается в том, что в качестве родительских используют не половые клетки (гаметы), а клетки тела растения, из которых изолируют протопласты. При определенном воздействии (химический-в суспензию добавляютвещества, стимулирующие слияние-фюзогенов; физическийсуспензий встраивают между двумя электродами(катодом и анодом)) протопласты заставляют сливаться друг с другом. Из полученных гибридных клеток в дальнейшем регенерируют целые растения-гибриды. По сравнению с половой она имеет ряд преимуществ: возможность скрещивания филогенетически отдаленных видов растений, получение асимметричных гибридов, гибридов, гетерозиготных по внеядерным генам и др. Недостатком метода является невозможность управления процессом и вследствие этого непредсказуемость результатов. С помощью соматической гибридизации между культурными растениями и дикими видами были получены: сорта картофеля, устойчивые к вирусным заболеваниям, фитофторозу, колорадскому жуку; томаты, устойчивые к вирусу табачной мозаики. гибридизация. Соматическая гибридизация растений включает четыре отдельных этапа: а) выделение протопластов; б) слияние протопластов; в) отбор и регенерация растений; г) анализ растений – регенерантов; Соматическая гибридизация позволяет: 1) скрещивать филогенетически отдаленные виды растений, которые невозможно скрестить обычным половым путем; 2) получать асимметричные гибриды, несущие весь генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами (или несколькими генами, или только органеллами и цитоплазмой) другого; 3) создать систему гибридизации, включающую одновременное слияние трех и более родительских клеток; 4) получать гибриды, представляющие собой в генетическом смысле сумму идиотипов родителей; 5) получать растения, гетерозиготные по внеядерным генам; 6) преодолевать ограничения, налагаемые генеративными системами несовместимости; 7) скрещивать формы, которые невозможно гибридизовать половым путем из-за аномалий в морфогенезе или гаметогенезе родителей; 8) гибридизовать клетки, несущие различные эпигенетические программы. Соматическая гибридизация является уникальным методом переноса ядерных и цитоплазматических геномов, позволяющим обойти проблему половой несовместимости у растений. При слияний двух протопластов истинная гибридная клетка образуется тогда, если сливаются ядра. В результате слияния протопластов можно получить после регенерации растения, создание которых невозможно половым путем: 1)растения, ядро которых происходит от одного родителя, а цитоплазма от другого ( цибриды); 2) растения, гетерозиготные по внеядерным генам ( цитогеты): 3) растения, часть внеядерных генов которых происходит от одного родителя, а часть от другого. 19. Многообразие получения сом-х гибридов с разл. сочетанием род-ких ядерных и цитопл-ких геномов (яд. гибриды, гетерокарион, цибриды, цитогеты и т.д.). Под сом. гибридизацией понимается гибридизация м\у протопластами, выделенными из соматических клеток растений. Для соматической гибридизации используют протопласты, полученные из мезофильных клеток листа или каллусных тканей. Соматическая гибридизация является уникальным методом переноса ядерных и цитоплазматических геномов, позволяющим обойти проблему половой несовместимости у растений. При слиянии двух протопластов истинная гибридная клетка образуется, если сливаются ядра. Клетка, в которой слияние ядер не произошло, называется гетерекарионом. Интересны возможности реконструкции растительной клетки путем такой гибридизации, когда в качестве одного или обоих родителей используются субпротопласты. Субпротопласт— это часть протопласта, окруженная цитоплазматической мембраной и несущая некоторые из органоидов клетки: ядро-нуклеопласт, протопласт без ядра — цитопласт, ядро и часть протоплазмы — мини-протопласты. Для пересадки пластид и митохондрий от одного вида другому могут использоваться цитопласты. Гибрид, несущий гены ядра только одного родителя наряду с цитоплазматическими генами от обоих либо от одного из родителей, называется цитоплазматическим (цибрид). Цитогеты цитоплазматические гетерозиготы - гибриды, несущие альтернативные цитоплазматические гены от обоих родителей. С учетом наличия в клетках, как минимум, двух цитоплазматических генофоров (митохондрий и хлоропласты) и сегрегации некоторых ядерных и внеядерных генов при соматической гибридизации возможно получение до 27 различных вариантов продуктов слияния. Культура гибридных клеток с получением каллусной ткани и индукцией в ней органогенеза дает возможность получить гибридное растение - регенерант. Первым гибридом высших растений, полученным методом соматической гибридизации П. Карлсоном с сотрудниками в 1972 г., был межвидовой гибрид Nicotiana glauca и N. langsdorfii. Из гибридных клеток был получен каллус, индукция органогенеза у которого дала проростки, из этих проростков были выращены гибридные растения, которые цвели. Эти гибриды были идентичны амфидиплоидным половым гибридам по морфологии, числу хромосом, изозимному составу пероксидазы. Выделение, культивирование, слияние протопластов, а также перенос в них отдельных клеточных органелл позволит генетикам и селекционерам расширить разнообразие получаемых гибридных растений. 20. Классификация антибиотиков. Антибио́тики— в-ва прир. или полусинтетического происх., подавляющие рост живых клеток, чаще всего прокариотических или простейших. По спектру д-я: антибактериальные(действующие на грамм+ бактерий, на грамм – бактерий, нтибиотики широкого спектра действия), противогрибковые, противоопухолевые. По хим-кой структуре: ациклические(нистатин),гетероциклические,ароматические гигромицин, аминогликозидные,полипептидные. По молекулярному механизму д-я: действующие на синтез бактериальной клет стенки, нарушающие синтез белка, нарушающие синтез белков и порядок генетического кода, нарушающие синтез НК, нарушающие целостность цитоплаз. мембраны. Наиболее используемые группы антибиотиков: макролиды; пенициллины; цефалоспоприны; фторхинолоны. Препараты обладают своими характерными свойствами. Классификация антибиотиков строится, в том числе, в зависимости от направленности их действия: антибактериальные; противоопухолевые; противогрибковые. Макролиды. Препараты этой группы наименее аллергенны и токсичны. Они относятся к антибиотикам широкого спектра действия и активны в отношении грамм(-) и грамм(+) бактерий, и атипичной флоры. Проникают внутрь микроба, т.е. обладают бактериостатическим действием и предотвращают деление и рост патогенных клеток. Они не вызывают перекрёстной с пенициллинами аллергии. Пенициллины. Это препараты широкого спектра действия, обладающие ярко выраженным бактерицидным действием, т.е. убивают клетки микробов-возбудителей, а также оказывают активное воздействие на атипичную флору, грамотрицательные и грамм(+) бактерии. Уровень концентрации пенициллина в очаге воспаления определяется уровнем его концентрации в плазме крови. Поэтому требуется длительный курс лечения и достаточно частый приём антибиотика. Сущ.: природные пенициллины, полученные из спор плесени и грибов; полусинтетические ингибиторозащищенные аминопенициллины и аминопенициллины. Цефалоспорины. Они обладают схожей с пенициллинами структурой. Это значит, что и механизм действия у этих препаратов схожий. Цефалоспорины могут вызывать у чувствительных пациентов аллергию. Эффективно использование цефалоспоринов в случаях: респираторные болезни, гонорея, пиелонефрит, тяжёлые ЛОРинфекции, профилактика осложнений перед масштабными хирургическими операциями. Фторхинолоны. Это антибиотики широкого спектра действия. Они обладают сильным бактерицидным д-ем, т.е. убивают кл-ки микробов-возбудителей, попадая внутрь, и оказывают действие на атипичную флору и грамотрицательные и грамположительные бактерии. Среди побочных действий фторхинолонов - негативное влияние на опорнодвигательную ф-цию и аппарат: разрыв сухожилий, артропия, тендинит. К наиболее известным антибиотикам данной группы относят: моксифлоксацин, спарфлоксацин, левофлоксацин, гемифлоксацин. Прим-ся же они при: синуситах; фарингитах; пневмониях; различных заболеваниях верхних дых-ных путей; урогенитальных инфекционных заболеваниях. 21. Вакцины. Типы вакцин (общая характеристика). Вакцины — иммунобиологические препараты, предназначенные для активной иммунопрофилактики, то есть для создания активной специфической невосприимчивости организма к конкретному возбудителю. В ответ на пероральное или парентеральное введение вакцины в организме хозяина вырабатываются антитела к патогенному микроорганизму, которые при последующей инфекции приводят к его инактивации (нейтрализации или гибели), блокируют его пролиферацию и не позволяют развиться заболеванию. Эффект вакцинации открыл более 200 лет назад — в 1796 г. — врач Эдвард Дженнер. Он доказал экспериментально, что человек, перенесший коровью оспу, не очень тяжелую болезнь крупного рогатого скота, становится невосприимчивым к оспе натуральной. В зависимости от природы иммуногена вакцины подразделяются на: 1. цельномикробные (цельновирионные) а) инактивированные или убитые б) живые аттенуированные . Живые вакцины получают путем искусственного аттенуирования или естественные авирулентные штаммы. Путем генной инженерии на уровне хромосом с использованием рестриктаз. Инактивированные получают путем воздействия на микроорганизмы химическим путем или нагреванием. 2. Химические. Содержат компоненты клеточной стенки или других частей возбудителя, как например в ацеллюлярной вакцине против коклюша, коньюгированной вакцине против гемофильной инфекции или в вакцине против менингококковой инфекции. 3. химерные (векторные). Гены вирулентного микроорганизма, отвечающий за синтез протективных антигенов, встраивают в геном какого-либо безвредного микроорганизма, который при культивировании продуцирует и накапливает соответствующий антиген. Примером яв-ся рекомбинантная вакцина против вирусного гепатита B, вакцина против ротавирусной инфекции. 4. синтетические. искусственно созданные молекулы. способны формировать иммунитет к разным видам инфекций (экспериментально получены синтетические вакцины против дифтерии, холеры, стрептококковой инфекции, гепатита В, гриппа, ящура, клещевого энцефалита, пневмококковой и сальмонеллёзной инфекций). Синтетические вакцины создают путем синтеза антигенных детерминант протективных вирусных белков. 22. Живые (цельномикробные, цельновирионные) и инактивированные вакцины. Среди цельномикробных (цельновирионных) вакцин выделяют инактивированные, или убитые, и живые аттенуированные. У первых возможность проявления патогенных свойств микроорганизма надежно устраняется за счет химической, термальной или иной обработки микробной (вирусной) взвеси, у вторых — за счет глубоких и стабильных изменений в геноме микроорганизма, исключающих вероятность возвращения к вирулентному фенотипу, т. е. реверсии. Эффективность живых вакцин определяется способностью аттенуированного микроорганизма размножаться в организме привитого, воспроизводя иммунологически активные компоненты непосредственно в его тканях. При использовании убитых вакцин иммунизирующий эффект зависит от количества иммуногена, вводимого в составе препарата, поэтому с целью создания более полноценных иммуногенных стимулов приходится прибегать к концентрации и очистке микробных клеток или вирусных частиц. Иммунизирующую способность инактивированных и всех других нереплицирующихся вакцин удается повысить путем сорбции иммуногена на крупномолекулярных химически инертных полимерах, добавления адъювантов, т. е. веществ, стимулирующих иммунные реакции организма, а также заключения иммуногена в мельчайшие капсулы, которые медленно рассасываются, способствуя депонированию вакцины в месте введения и пролонгированию, тем самым, действия иммуногенных стимулов. Живые вакцины содержат ослабленный живой микроорганизм (вакцины против полиомиелита, кори, паротита, краснухи, туберкулезa). Живые вакцины получают путем искусственного аттенуирования (ослабления штамма (BCG - 200-300 пассажей на желчном бульоне, ЖВС - пассаж на ткани почек зеленых мартышек) или естественные авирулентные штаммы. Путем генной инженерии на уровне хромосом с использованием рестриктаз. Положительные стороны: может приживляться в организме, - могут длительно сохранять иммунитет, - используют небольшие дозы. Отрицательные стороны: - содержит 99%балласта, - способна вызывать мутации клеток организма (хромосомные аберрации), опасно в отношении половых клеток, - содержат вирусы-загрязнители (контаминанты), - трудно дозируются, чувствительны к действию высоких температур. Инактивированные получают путем воздействия на микроорганизмы химическим путем или нагреванием. Инактивированные вакцины выпускают как в сухом, так и в жидком виде. Положительные стороны: - легче дозировать - лучше очищать - длительно хранятся - менее чувствительны к температурным колебаниям. Отрицательные стороны: - содержит 99 % балласта, содержит агент, используемый для умерщвления микробных клеток(фенол), микробный штамм не приживляется. 23. Корпускулярные и генно-инженерные (векторные) вакцины. Корпускулярные убитые вакцины (из цельных микробных тел) получают путем посева вакцинных штаммов микробов на питательные среды, разлитые в избранную посуду (матрацы, бутыли различной емкости). Для культивирования бактерий кишечно-тифознопаратифозной группы применяют мясо-пептонный агар. Засеянную питательную среду выдерживают в термальной комнате. Для накопления большого количества микробной массы вакцинный штамм размножают в специальных аппаратах (реакторах, устроенных по типу вертикального автоклава), в жидких аэрируемых питательных средах. Этот способ дает возможность в течение нескольких часов получить в 1 мл среды до 14-15 млрд. микробных тел. Организм человека и животных способен вырабатывать иммунитет одновременно против нескольких инфекционных заболеваний, если ввести вакцину, содержащую различные антигены. При правильном подборе антигенов, их активности и дозировок они не подавляют друг друга, а способствуют созданию специфического иммунитета к каждому из них в иммунизированном организме. Некоторые ассоциированные вакцины вошли в противоэпидемическую практику для активной иммунизации против острых воздушнокапельных детских заболеваний. Вакцины, полученные методами генной инженерии. Гены вирулентного микроорганизма, отвечающий за синтез протективных антигенов, встраивают в геном какого-либо безвредного микроорганизма, который при культивировании продуцирует и накапливает соответствующий антиген. Примером яв-ся рекомбинантная вакцина против вирусного гепатита B, вакцина против ротавирусной инфекции. Имеются положительные результаты использования векторных вакцин, когда на носитель — живой рекомбинантный вирус осповакцины (вектор) наносятся поверхностные белки двух вирусов: гликопротеин D вируса простого герпеса и гемагглютинин вируса гриппа А. Происходит неограниченная репликация вектора и развивается адекватный иммунный ответ против вирусной инфекции обоих типов. 24. Генная инженерия растений. Генетическая инженерия — это конструирование функционально активных генетических структур в виде рекомбинантных молекул ДНК. Этим методом можно перестраивать геном организмов по намеченному плану, изменяя содержащуюся в них генетическую информацию. Генная инженерия —это методы и технологии, связанные с целенаправленным созданием in vitro новых комбинаций генетического материала, способного размножаться в клетке-хозяине и синтезировать конечные продукты обмена. Суть генетической инженерии состоит в переносе отдельных генов из одного организма в другой. Это стало возможно после открытия ферментов рестриктаз и лигаз. Рестриктазы рассекают молекулу ДНК по строго определенным местам. Сейчас обнаружено более 500 рестриктаз, расщепляющих специфические нуклеотидные последовательности в ДНК. Полученные фрагменты ДНК имеют комплементарные, или липкие, концы и могут быть сшиты в единое целое ферментами ДНК-лигазами. С помощью этих ферментов из набора рестриктазных фрагментов ДНК, содержащих нужный ген, собирается рекомбинантная ДНК, которая затем различными способами вводится в клетку. Новая генетическая информация экспрессируется, и клетка начинает синтезировать продукт, кодируемый введенным геном. Вводя в клетку новую генетическую информацию в виде гибридных молекул ДНК, можно получить организм с новым признаком. Такой организм называется трансгенным, или трансформированным. Впервые рекомбинантная ДНК была получена в 1972 г. в лаборатории Берга в ней были соединены фрагменты ДНК фага λ, кишечной палочки и полный геном онкогенного обезьяньего вируса 40. Первые работы по генетической инженерии растений начались в 1980 г. на основе культуры клеток. В 1983 г. был получен каллус, а затем и химерное растение санбин, представляющее собой подсолнечник, в геноме которого работали гены, кодирующие запасной белок бобов фазеолин. Генетическая инженерия как способ переноса генов обещает стать эффективным инструментом в селекции культурных растений. В настоящее время генетическая инженерия растений достигла определённых успехов. Методической основой генной инженерии является культура изолированных протопластов, полученных либо из клеток мезофилла листа, либо из каллусной ткани. Протопласт, получивший новую генетическую информацию, может быть клонирован по схеме: протопласт — суспензионная культура — каллусная культура — целое растение. Помимо соматических клеток, для генетической трансформации могут быть использованы пыльца, яйцеклетка или только что оплодотворенная яйцеклетка. Применяя методы генетической инженерии в культуре клеток, можно конструировать принципиально новые формы растений с ценными качествами. Генноинженерные работы с растениями складываются из следующих этапов: - получение структурного гена, предназначенного для переноса в другой организм; - включение его в вектор, то есть создание рекомбинантной ДНК; - перенос рекомбинантной ДНК в клетки растений; - анализ экспрессии чужеродной ДНК в растительных тканях; - регенерация полноценных растений из отдельных клеток с измененным геномом. Вектор — молекула ДНК, используемая в генетической инженерии для передачи генетического материала другой клетке. Вектор должен обладать следующими свойствами: 1. Способность к автономной репликаций. 2. Наличие сайта, в котором возможно встраивание желаемого фрагмента ДНК. 3. Наличие одного или нескольких маркерных генов, благодаря которым клетка-реципиент будет обладать новыми признаками, позволяющими отличить трансформированные клетки. Это могут быть селективные гены, которые придают клеткам селективное преимущество (устойчивость к антибиотикам). Плазмиды – внехромосомные генетические элементы прокариот, которые автономно реплицируются в клетке. Плазмида, испольуемая в качестве вектра, должна имеет 3 характеристики: иметь сайт ori(участок инициаций репликаций) для нормальной репликаций ДНК и размножения плазмидвы в клетке, доминантный селективный маркер, который позволяет отобрать клетку,несущую плазмиду с встроенным фрагментом чужеродной ДНК, иметь сайт рестрикций. Природные плазмиды часто содержат гены, полезные для бактерий: придающие устойчивость к антибиотикам . Например, широко используемый плазмидный вектор рBR322. 25. Трансгенные животные. Получение и практическое применение. Трансгенные животные - это экспериментально полученные животные, содержащие во всех клетках своего организма дополнительную интегрированную с хромосомами чужеродную ДНК (трансген), которая передается по наследству. Получение трансгенных животных осуществляется с помощью переноса клонированных генов (ДНК) в ядра оплодотворенных яйцеклеток (зигот) или эмбриональных стволовых (плюрипотентных) клеток. Затем в репродуктивные органы реципиентной самки пересаживают модифицированные зиготы или яйцеклетки, у которых собственное ядро заменено на модифицированное ядро эмбриональных стволовых клеток, либо бластоцисты (эмбрионы), содержащие чужеродную ДНК эмбриональных стволовых клеток. Первые трансгенные животные были получены в 1974 в Кембридже Рудольфом Янишем в результате инъекции в эмбрион мыши ДНК вируса обезьяны SV40. В 1980 американским ученым Жоржем Гордоном с соавторами было предложено использовать для создания трансгенных животных микроинъекцию ДНК в пронуклеус зиготы. Именно этот подход положил начало широкому распространению технологии получения трансгенных животных. С помощью микроинъекций в пронуклеус зиготы в 1985 в США были получены первые трансгенные сельскохозяйственные животные (кролик, овца, свинья). В настоящее время для создания трансгенных животных, кроме микроинъекций, используются другие экспериментальные приемы: инфицирование клеток рекомбинантными вирусами, электропорация, «обстрел» клеток металлическими частицами с нанесенными на их поверхности рекомбинантными ДНК. Все имеющиеся методы переноса генов пока еще не очень эффективны. Для получения одного трансгенного животного в среднем необходимы микроинъекции ДНК в 40 зигот мышей, 90 зигот козы, 100 зигот свиньи, 110 зигот овцы и в 1600 зигот коровы. Механизмы интеграции экзогенной ДНК или формирования автономных репликонов при трансгенозе не известны. Встраивание трансгенов у каждого вновь получаемого трансгенного животного происходит в случайные участки хромосом, может происходить встраивание как единичной копии трансгена, так и множества копий, располагающихся тандемно в единичном локусе одной из хромосом. Гомология между сайтом интеграции трансгена и самим трансгеном отсутствует. При использовании для трансгеноза эмбриональных стволовых клеток возможна предварительная селекция, что позволяет получать трансгенных животных с трансгеном, интегрированным в результате гомологичной рекомбинации с определенным участком генома хозяйского организма. С помощью этого подхода осуществляют целенаправленное прекращение экспрессии определенного гена (это называют «нокаутом гена»). Трансгенные животные широко используются как для решения большого числа теоретических задач, так и в практических целях для биомедицины и сельского хозяйства. Некоторые научные проблемы не могли бы быть решены без создания трансгенных животных. На модели трансгенных лабораторных животных проводятся широкие исследования по изучению функции различных генов, регуляции их экспрессии, фенотипическому проявлению генов, инсерционному мутагенезу и др. Трансгенные животные важны для различных биомедицинских исследований. Существует множество трансгенных животных, моделирующих различные заболевания человека (рак, атеросклероз, ожирение и др.). Так, получение трансгенных свиней с измененной экспрессией генов, определяющих отторжение органов, позволит использовать этих животных для ксенотрансплантации (пересадки органов свиньи человеку). В практических целях трансгенные животные используются различными зарубежными фирмами как коммерческие биореакторы, обеспечивающие производство разнообразных медицинских препаратов (антибиотиков, факторов свертываемости крови и др.). Перенос новых генов позволяет получать трансгенных животных, отличающихся повышенными продуктивными свойствами (например, усиление роста шерсти у овец, понижение содержания жировой ткани у свиней, изменение свойств молока) или устойчивостью к различным заболеваниям, вызываемым вирусами и другими патогенами. 26. Клеточная реконструкция. Клеточная инженерия— комплекс методов, позволяющий конструировать клетки нового типа на основе их культивирования, гибридизации и реконструкции. Базовым методом К.и. служит гибридизация клеток, с помощью которой соединяются геномы далеких видов организмов. Клеточная реконструкция связана с созданием жизнеспособной клетки из отдельных фрагментов разных клеток (ядра, цитоплазмы, хромосом, митохондрий и др.). К.и. — один из основных подходов в современной биотехнологии; используется как для решения теоретических проблем, так и для создания новых форм организмов, обладающих полезными для практики признаками. Начало клеточной инженерии относят к 1960-м гг., когда возник метод гибридизации соматических клеток. К этому времени были усовершенствованы способы культивирования животных клеток и появились способы выращивания в культуре клеток и тканей растений. Соматическую гибридизацию, т. е. получение гибридов без участия полового процесса, проводят, культивируя совместно клетки различных линий одного вида или клетки различных видов. При определённых условиях происходит слияние двух разных клеток в одну гибридную, содержащую оба генома, объединившихся клеток. Удалось получить гибриды между клетками животных, далёких по систематическому положению, напр. мыши и курицы. Соматические гибриды нашли широкое применение как в научных исследованиях, так и в биотехнологии. С помощью гибридных клеток, полученных от клеток человека и мыши и человека и китайского хомячка, была проделана работа по картированию генов в хромосомах человека. Гибриды между опухолевыми клетками и нормальными клетками иммунной системы (лимфоцитами) – т. н. гибридомы – обладают свойствами обеих родительских клеточных линий. Подобно раковым клеткам, они способны неограниченно долго делиться на искусственных питательных средах (т. е. они «бессмертны») и, подобно лимфоцитам, могут вырабатывать моноклональные (однородные) антитела определённой специфичности. Такие антитела применяют в лечебных и диагностических целях, в качестве чувствительных реагентов на различные органические вещества и т. п. Другое направление клеточной инженерии – манипуляции с безъядерными клетками, свободными ядрами и другими фрагментами, сводящиеся к комбинированию разнородных частей клетки. Эти эксперименты, а также микроинъекции в клетку хромосом, красителей и т. п. проводят для выяснения взаимных влияний ядра и цитоплазмы, факторов, регулирующих активность генов, и т. п. Путём соединения клеток разных зародышей на ранних стадиях их развития выращивают мозаичных животных, или химер, состоящих из двух различающихся генотипами видов клеток. С помощью таких экспериментов изучают процессы дифференцировки клеток и тканей в ходе развития организма. 27. Культура микроорганизмов (цели и задачи культивирования, способы и условия культивирования). Культура микроорганизмов - популяция микроорганизмов на пит. среде, находящаяся в состоянии размножения или закончившая его. Чистая культура состоит из микроорганизмов одного вида, смешанная — из нескольких. Элективной культурой наз. такую, в к-рой из большого числа форм, имеющихся в посевном материале, растёт преимущественно один вид. Поддерживают культуру микроорганизмов на жидких или твёрдых пит. средах в колбах или пробирках, предохраняя от высыхания и тормозя процессы метаболизма понижением температурыры хранения, периодически пересевают на свежую среду. Для длительного, хранения культуры высушивают под вакуумом в специальных защитных средах и запаивают в ампулах или хранят в жидком азоте. При культивировании микроорганизмов поддерживаются оптимальные физико-химические условия: температура, аэрация, газовая среда, рН, окислительно-восстановительный потенциал, солёность. Для культивирования микроорганизмов применяется специальная аппаратура. Известны методы получения культур из одной изолированной клетки с наблюдением под микроскопом и методы микрокультивирования (в капле среды, в капиллярах). Выбор процесса культивирования зависит не только от потребностей организма, но и от того, для чего будет использована культура, т. е., от конечной цели эксперимента. Известно много процессов культивирования микроорганизмов. Они различаются по: 1) состоянию питательной среды (поверхностные и глубинные); 2) наличию или отсутствию перемешивания (динамические или статические); 3) содержанию кислорода (аэробные или анаэробные); 4) способу действия (периодические, непрерывные); 5) количеству ферментеров (одно-, дву- и многостадийные); 6) способу управления (хемостатные, турбидостатные, оксистатные, рН-статные и другие). Различают два основных способа культивирования микроорганизмов – периодическое и непрерывное. При периодическом культивировании клетки помещают в закрытый сосуд определенного объема, содержащий питательную среду, и задают начальные условия. Постепенно увеличивается плотность популяции, снижается концентрация питательных веществ и накапливаются продукты обмена, т.е. условия существования микроорганизмов изменяются. Периодическую культуру обычно рассматривают как замкнутую систему, переживающую разные фазы развития. Каждая фаза характеризуется определенными физиологическими параметрами. Лаг-фаза – это фаза «привыкания» клеток к среде, при этом происходит увеличение количества ДНК и РНК и индукция синтеза соответствующих ферментов. В экспоненциальной (логарифмической) фазе клетки растут и делятся с максимальной скоростью, их рост не ограничен. Когда исчерпание питательных веществ и накопление продуктов метаболизма преодолеют некие пороговые концентрации, начинается фаза отмирания и число клеток в популяции постепенно снижается. Непрерывное культивирование позволяет зафиксировать культуру в какой-то определенной фазе (обычно экспоненциальной). При этом состав среды и условия роста остаются постоянными. Этого добиваются постоянным прибавлением новой питательной среды в сосуд для выращивания и одновременным удалением такого же количества среды с клетками. Подача свежей среды и удаление части суспензии происходит с той же скоростью, с какой растет культура. В этом случае устанавливается динамическое равновесие. 28. Культура клеток растений (цели и задачи культивирования, способы и условия культивирования). Культурой клеток растений наз-ся выращивание отдельных кл-к, тканей и органов растений на искусственной пит-ной среде в асептических ус-ях. Кусочек простеризованной раст-ной клетки помещают в чашку Петри или пробирку на агаризованную пит-ную среду. После этого в ткани начинается интенсивное деление клеток. Клеточная масса быстро разрастается, образуя каллус. Каллус – это особый тип ткани, представляющий собой скопление недифференцированных кл-к. Если затем кусочки этого каллуса периодически пересаживать на свежую пит-ную среду, то они могут расти неограниченно долго. Термин «культура клеток растений» превратился в широкое понятие, охватившее все виды работы in vitro с культурами изолированных кл-к, тканей, органов, зародышей и целых растений – регенерантов. Термин in vitro исп-ся для описания условий протекания процессов в стерильной искусственной окружающей среде. Растение – регенерант означает асептически полученное растение с развитыми корнями и побегами, сформировавшиеся в культуре, то есть in vitro. Культура клеток требует стерильности самих культивируемых эксплантов, пит-ных сред, посуды, инструментов и лабораторного помещения. Лучше всего работу по выделению тканей из растений и их высадку на пит-ную среду проводить в ламинарном боксе. Из простерилизованных различными способами и тщательно промытых в стерильной дист. воде объектов изолируют нужные ткани и помещают их на предварительно проавтоклавированную пит-ную среду. Возможно культивирование любых тканей и органов растений. Успех в культивировании клеток, тканей и органов прежде всего опред-ся составом питательной среды. Культура кл-к каждого вида растений и даже разных органов и тканей одного и того же вида требует пит-ной среды определенного состава. Более того, для инициации каллуса, поддержания его роста, для индукции органогенезе нужно в каждом из этих случаев изменять состав среды. Для глубинного культивирования раст-ных кл-к применимы способы, разработанные в микробиологии. Различают два вида систем культивирования: открытую и закрытую. Для закрытой системы характерен периодический режим выращивания. Клеточная масса помещается в определенный объем среды. Система закрыта по всем параметрам, кроме газов, до конца выращивания. Периодически подается свежая пит-ная среда, а старая удаляется в том же объеме. Клетки остаются в системе в течение всего цикла выращивания. Открытые культуры хар-ся поступлением свежей питательной среды, при котором отбирается не только старая пит-ная среда, но и часть урожая клеточной массы. Наиболее изучено и распространено закрытое глубинное культивирование. Для аэрации и перешивания используют различную аппаратуру: роллеры, качалки, магнитные мешалки и т.д. Очень большое значение для роста и биосинтеза кл-к in vitro имеют технические хар-ки систем культивирования. На рост кл-к, кроме кислорода, могут влиять и другие газы. Углекислый газ может существенно влиять на длину лаг-фазы. Высокая степень аэрации может оказывать негативное действие на рост и синтез продуктов вторичного метаболизма, поскольку удаляются углекислый газ и летучие соединения. Клетки растений in vitro по сравнению с микроорганизмами имеют низкую интенсивность дыхания, что тоже должно учитываться при конструировании сосуда для культивирования. Отличительная особенность суспензионных культур кл-к растений — высокая плотность, необходимая для роста. Поэтому другим осложнением при культивировании клеток растений является увеличение вязкости, сопровождающее рост биомассы. Это ведет к адгезии (прилипание) В верхней части сосуда постепенно может образовываться пена, состоящая из выделяемых клетками белков и полисахаридов. В процессе культивирования клетки слипаются и часть из них скапливается в этой пене, образуя «корку», или «безе». С увеличением биомассы клеток увеличивается и эта «корка», снижая интенсивность перемешивания, что в конце концов может привести культуру к гибели. Периодическое, или накопительное, культивирование — это самый простой способ выращивания клеток. Суспензионные культуры используют для промышленного получения вторичных метаболитов. 29. Культура клеток животных (цели и задачи культивирования, способы и условия культивирования). Культура животных клеток-этто гомогенная популяция генетически однородных клеток растущих в постоянных условиях. В соответствии с целями и задачами экспериментальной работы можно выделить два направления культивирования животных клеток:культуры клеток; культуры органов и тканей (органные культуры). Питательная среда представляет собой раствор определенного состава, к которому добавляются компоненты невыясненного биологического происхождения (добавки плазмы, сыворотки крови, тканевые экстракты и т.д.). Основу питательных сред составляют солевые растворы. Минеральные компоненты в этих растворах подобраны так, что раствор выполняет буферные функции, поддерживая постоянный кислотнощелочной баланс среды в процессе культивирования. Постоянство рН среды является одним из главных требований условий культивирования. Другим важным условием культивирования является осмотическое давление. Оно определяется числом молей осмотически активных частиц (ионов и неионизированных молекул) растворенных веществ на 1 кг растворителя (осмоляльность) или на 1 литр раствора (осмолярность). Характерные особенности культуры клеток животных: 1)питательная среда- классическая срде Игла,которая содержит смесь аминокислот, витаминов,солей и углеводов. В эту среду входит 20 аминокислот, из них 8 незаминимых и 7 витаминов.2) зависимость от прикрепления и рост в суспензий: большинство клеток млекопитающих могут расти только на прикрепленном субстрате. В качестве субстрата используется коллаген. Найболее распространенным субстратом яв-ся желатин-денатурированный коллаген.3) клеточный цикл: растущие клетки млекопитающих делятся примерно 1 раз в каждые 24 часа. Культура ткани, культура клеток - метод, позволяющий сохранять жизнеспособность клетки и выращивать клетки, ткани, небольшие органы (или их части) животного, включая человека, или растения вне организма на/в питательной среде. Эту сохраняемую или выращиваемую часть выделяют из живого организма. Культура ткани применяется для фундаментальных исследований и практических тестов..Применение:Лекарств и БАВ ( интерферон, витамины, медиаторы, гормоны, антитела, иммунные препараты)Диагностикумов ,Ферментов и белков,Получение новых форм и пород животных. Клонирование животных. Сохранение генофонда .Использование в трансплантологии (стволовые клетки) Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) - тип плюрипотентных клеток млекопитающих, поддерживаемых в культуре. Получают из внутренней клеточной массы бластоцисты на ранней стадии развития зародыша. Зародыш человека достигает стадии бластоцисты спустя 5-6 дней после оплодотворения, бластоциста человека состоит из 50-150 клеток. Эмбриональные стволовые клетки являются плюрипотентными. Это означает, что они могут дифференцироваться во все три первичных зародышевых листка: эктодерму, энтодерму имезодерму. Стволовые клетки взрослых организмов и стволовые клетки спинного мозга используются для терапии различных заболеваний. Некоторые заболевания крови и иммунной системы (в том числе генетические) могут быть излечены стволовыми клетками неэмбрионального происхождения. Существует 2 основных системы культивирования клеток. 1. Непроточные культуры - тип культур, в котором клетки вводят в фиксированный объем среды. По мере роста клеток происходит использование питательных веществ и накопление метаболитов, поэтому среда должна периодически меняться, что приводит к изменению клеточного метаболизма, называемого еще и физиологической дифференцировкой. Со временем, в результате истощения среды происходит прекращение пролиферации клеток. 2. Проточные культуры обеспечивают истинные гомеостатические условия без изменения концентрации питательных веществ и метаболитов, а также числа клеток. Гомеостаз обусловлен постоянным вхождением среды в культуру и одновременным удалением равного объема среды с клетками. Такие системы пригодны для суспензионных культур и монослойных культур на микроносителях. Для животных клеток диапазон оптимального существования очень узок. Это касается и температурных условий, и состава питательных сред (необходимо строго выдерживать pH, молярность и т.д.), и газового состава. Пожалуй, наименее требовательны они к освещению. Для выращивания животных клеток всегда используют готовые фабричные питательные среды, а для длительного поддержания линии нужен термостат. Для некоторых видов клеток газовый состав воздуха можно обеспечить, поместив флаконы с культурой в эксикатор (емкость с притирающейся крышкой) в который также помещают горящую свечку. Когда эксикатор плотно закрыт, свеча затухает сама при концентрации углекислого газа в воздухе 5%. 30. Культура клеток низших растений (культура водорослей). Водоросли используются, в основном, для получения белка. Весьма перспективны в этом отношении и культуры одноклеточных водорослей, в частности высокопродуктивных штаммов рода Chlorella и Scenedesmus. Их биомасса после соответствующей обработки используется в качестве добавки в рационы скота, а также в пищевых целях. Одноклеточные водоросли выращивают в условиях мягкого теплого климата (Средняя Азия, Крым) в открытых бассейнах со специальной питательной средой. Хлорелла содержит около 50 % белка, а люцерна — лишь 18 %. В целом в пересчете на 1 га хлорелла образует 20—30 т чистого белка, а люцерна — 2—3,5 т. Кроме того, хлорелла содержит 40 % углеводов, 7—10 % жиров, витамины А (в 20 раз больше), B2, К, РР и многие микроэлементы. Варьируя состав питательной среды, можно процессы биосинтеза в клетках хлореллы сдвинуть в сторону накопления либо белков, либо углеводов, а также активировать образование тех или иных витаминов. В пищу употребляют не менее 100 видов макрофитных водорослей из них готовят много разнообразных блюд, в том числе диетических, салатов, приправ. Их подают в виде засахаренных кусочков, своеобразных конфет, из них варят варенье, делают желе, добавки к тесту, консервы из морской капусты — ламинарии дальневосточных или северных морей. Ее консервируют с мясом, рыбой, овощами, рисом, употребляют при приготовлении супов и др. Она наряду с микроводорослью хлореллой является самой популярной съедобной и кормовой водорослью. Известны и другие съедобные макрофитные водоросли — ульва, из которой делают разные зеленые салаты, а также алария, порфира, родимения, хондрус, ундария и др. до 85% сухой массы клеток. После переработки водоросли можно использовать вкачестве корма для животных, так как у них нет неперевариваемой клеточной оболочки,присущей другим водорослям. Они также содержат значительное количество β-каротина. Наряду с кормами водоросли давноприменяют в сельском хозяйстве в качестве удобрений. Биомасса обогащает почву фосфором,калием, йодом и значительным количеством микроэлементов, пополняет также еебактериальную, в том числе азотфиксирующую, микрофлору. При этом в почве водорослиразлагаются быстрее, чем навозные удобрения, и не засоряют ее семенами сорняков, личинками вредных насекомых, спорами фитопатогенных грибов. единиц воды, образуя при этом вязкие растворы. Бурые водоросли богаты также весьма полезным соединением — шестиатомным спиртом маннитом, который с успехом применяют в пищевой промышленности, фармацевтике, при производстве бумаги, красок, взрывчатки и др. Бурые водоросли в ближайшее время планируется использовать для получения биогаза. лужит красная водоросль анфельция. Бурые водоросли являются единственным источником получения одних из самых ценных веществ водорослей — солей альгиновой кислоты, альгинатов. Альгинаты исключительно широко применяются в народном хозяйстве. Это изготовление высококачественных смазок для трущихся деталей машин, медицинские и парфюмерные мази и кремы, синтетические волокна и пластики, стойкие к любой погоде лакокрасочные покрытия, не выцветающие со временем ткани, производство шелка, клеящих веществ исключительно сильного действия, строительных материалов, пищевые продукты отличного качества — фруктовые соки, консервы, мороженое, стабилизаторы растворов, брикетирование топлива, литейное производство и многое другое. 31. Изобразите в виде схемы этапы технологии получения рекомбинантной ДНК. Технология рекомбинантных ДНК — это совокупность экспериментальных процедур, позволяющая осуществлять перенос генетического материала (ДНК) из одного организма в другой. Никакого единого, универсального набора методик не сушествует, но чаше всего эксперименты с рекомбинантной ДНК проводят по следующей схеме: 1)Из организма — донора нужных генов — экстрагируют нативную ДНК (клонируемая ДНК, встраиваемая ДНК, ДНК-мишень, чужеродная ДНК), подвергают ее ферментативному гидролизу (расщепляют, разрезают) и соединяют (лигируют, сшивают) с другой ДНК (вектор для клонирования, клонирующий вектор) с образованием новой, рекомбнантной молекулы (конструкция «клонирующий вектор—встроенная ДНК»). ↓ 2)Эту конструкцию вводят в клетку-хозяина (реципиент), где она реплицируется и передается потомкам. Этот процесс называется трансформацией. ↓ 3)Идентифицируют и отбирают клетки, несущие рекомбинантную ДНК (трансформированные клетки). ↓ 4)Получают специфический белковый продукт, синтезированный клетками-хозяевами, что служит подтверждением клонирования искомого гена. Амплификация рекомбинантной ДНК в трансформированных клетках. 32. Культура клеток как модельный объект изучения действия на организм, ткани и органы различных биологически активных соединений, лекарственных средств, токсинов, патогенов и т.д. Культивируемые клетки и ткани имеют большую ценность как модель для изучения метаболизма и его регуляции, роста и развития растений. При использовании этого метода объектом исследования является клетка, как единица биологической организации и активности. Именно этим методом была экспериментально доказана тотипотентность растительной клетки. В культуре тканей нет тканевого разнообразия, и возможно изучение процессов вне контроля со стороны других тканей, органов и целого организма. Достоинством метода культуры тканей является возможность строгого контроля за условиями выращивания и более эффективного воздействия различными экзогенными химическими и физическими факторами. Выращивание клеток в асептических условиях исключает артефакты, вносимые микроорганизмами. Экспериментальный материал можно получать круглый год. Эти преимущества позволяют использовать культуру клеток как биологическую модель, близкую к естественному состоянию, для решения ряда задач физиологии, биохимии, генетики растений. Для того чтобы клетки, ткани in vitro служили биологической моделью, должны быть созданы такие условия культивирования, которые максимально приближаются к нативным. В этом случае состояние клетки будет определяться генетической информацией, которая была активна in vivo, то есть клетка остается без изменения. Вместе с тем такие клетки и ткани, лишенные некоторых механических, физико-химических защитных барьеров и систем, освобожденные от межклеточных взаимодействий, дают прямую ответную реакцию на любые воздействия, что позволяет проследить состояние клетки на уровне первичных элементарных процессов. Однако следует подчеркнуть, что культура клеток и тканей как модель имеет существенные недостатки, а именно: генетическую нестабильность длительно выращиваемых культур и неразработанность условий синхронизации таких важных морфогенетических процессов, как соматический эмбриогенез, стеблевой и корневой органогенез. При использовании культуры клеток и тканей для моделирования физиологических процессов важно помнить, что клетки in vitro и в живом организме не всегда равноценны. Несомненно, что дальнейшее изучение биологии культивируемой клетки и совершенствование методов культивирования с целью максимального приближения условий in vitro к нативным позволят по-новому и эффективно решать многие проблемы биологии растений. Культура клеток используется для изучения основного и вторичного метаболизма, его регуляции путем блокирования или усиления работы отдельных ферментов, а также под влиянием различных факторов. Так, например, в Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева применяли культуру тканей сахарной свеклы для изучения процессов поступления, использования и отложения в запас сахара. В культуре тканей легче использовать меченые органические соединения для изучения их метаболизации тканями и клетками. Для исследования механизма действия фитогормонов, их метаболизма и функции представляют ценность клеточные культуры, растущие безгормональных добавок в среде — прототрофные по гормонам, или гормононезависимые.Такие культуры появляются в результате так называемого привыкания, а также индуцированного мутагенеза и отбора на селективных средах и при опухолевой трансформации. Основным методическим подходом к изучению дифференцировки и морфогенеза в культуре in vitro, как и на целом организме, является физиологический эксперимент. 33. Использование культур клеток для лечения болезней. В настоящее время использование культур клеток млекопитающих выходит далеко за рамки искусственного оплодотворения. Клетки млекопитающих могут дополнять, а возможно, когда-нибудь и заменят использование животных для тестирования безопасности и эффективности новых лекарственных препаратов. Так же как клетки растений и насекомых, клетки млекопитающих могут быть использованы для синтеза лекарственных веществ, особенно некоторых животных белков, слишком сложных для того, чтобы синтезировать их с помощью генетически модифицированных микроорганизмов. Например, моноклональные антитела синтезируются именно культурами клеток млекопитающих. Стволовые клетки применяются при лечении более 80 серьезных заболеваний, таких как острые и хронические лейкозы, болезни крови и иммунной системы, а также для восстановления кроветворения после высокодозной химиотерапии. При данных заболеваниях показана трансплантация гемопоэтических стволовых клеток. В настоящее время учеными проводится изучение применения стволовых клеток для восстановления всех тканей организма. Стволовые клетки, выделенные из пуповинной крови, могут применяться в будущем при лечении детского церебрального паралича, болезни Альцгеймера, диабета, заболеваний сердца и печени, мышечной дистрофии, болезни Паркинсона, рассеянного склероза, повреждениях позвоночника и других видов распространенных заболеваний. Методы терапии, основанные на использовании культур взрослых стволовых клеток, обнаруженных в некоторых тканях организма (костном мозге, жировой ткани, мозге и др.), также скоро займут достойное место в клинической практике. Исследователи установили, что стволовые клетки могут быть использованы организмом для восстановления поврежденных тканей. Взрослые гемопоэтические стволовые клетки уже давно используются в качестве трансплантатов костного мозга. Они необходимы для восстановления процессов созревания и формирования всех типов клеток крови. Такие клетки могут быть в больших количествах получены из пуповинной крови, однако их выделение является довольно сложным процессом. В настоящее время исследователи работают над методами выделения стволовых клеток из плаценты и жировой ткани. Ряд специалистов занят разработкой методов клеточного ре-программирования – возвращения в недифференцированное состояние зрелых клеток организма, например, клеток кожи, и последующей стимуляции их дифференцирования в клетки необходимого типа ткани. Использование эмбриональных стволовых клеток также рассматривается в качестве потенциального метода терапии многих заболеваний. Максимальная ценность терапии с использованием стволовых клеток и тканевой инженерии может быть достигнута в том случае, если терапевтические стволовые клетки и ткани, выращенные из них, являются генетически идентичными клеткам реципиента. Поэтому, если сам пациент не является их источником, стволовые клетки должны быть модифицированы методом замещения их генетического материала генами реципиента и только потом дифференцированы в клетки специфического типа. На настоящее время процедура замещения генетического материала и ре-программирования может быть успешно проделана только с эмбриональными стволовыми клетками. С помощью технологии рекомбинантной ДНК получены генетически модифицированный штамм E.coli, продуцирующий человеческий инсулин и бактерии, синтезирующие соматотропин, необходимый в лечении карликовости. 34. Методы получения химерных животных (изобразите схему получения аллоферных мышей). Химерные животные — это генетические мозаики, образующиеся в результате объединения бластомеров от эмбрионов с разными генотипами. Сущность метода получения химер заключается в искусственном объединении эмбриональных клеток двух и более животных. Животные могут быть как одной породы, так и разных пород и даже разных видов. Современная микрохирургия позволяет получать химер, имеющих 3—4 и более родителей. Химеры обладают признаками животных разных генотипов. Методы получения химер 1. Агрегационный — объединение двух и более морул или бластоцист в один эмбрион. Был предложен практически независимо друг от др. Тарковским и Минц (1961-1962 гг.). Из матки беременных самок-докторов извлекают зародыши на стадии 8 бластомеров. Бластомеры от 2 животных с различными генотипами помещают в условия, способствующие их агрегации и образованию 16-ти клеточного зародыша. Такие зародыши развиваются in vitro до стадии бластоцисты, после чего их вводят в матку приемной матери, у к-й вызывают ложную беременность вводя гормоны. В результате получаются аллофенные мышата. Когда у мышонка появляется шерсть, окраска у него - смешанная, с чередующимися черными и белыми пятнами или полосами. Ткани животных-химер мозаичны. Различия могут касаться белков, выполняющих фермент. фун-ю: могут катализировать одни и те же реакции у мышей-родителей, нуждаться в одних и тех же кофакторах, но при этом быть не идентичными, хотя и сходными (изоферменты). Агрегационные химеры можно получать м/у различным числом изолированных бластомеров или отдельными частями эмбрионов. Преимущество метода - не требует вмешательства микрохирургической техники. 2. Инъекционный - микроинъекция клеток внутриклеточной массы (ВКМ) бластоцисты доноров в бластоцель эмбриона-реципиента. Разработан Р. Гарднером в 1968 г. Используются эмбрионы на стадии бластоцисты. Бластоцисту фиксируют и, используя микроманипуляторы, вводят путем инъекции клетки внутриклеточной массы бластоцисты доноров в бластоцель эмбриона - рецепиента. Этим методом можно инъецировать не только внутриклеточную массу ранних эмбрионов, но и более дифференцированные клетки. Химеры не передают потомкам генетическую мозаичность. У них - расщепление, как у гетерозигот, поэтому ценные генетические комбинации нарушаются. Но на протяжении 1 поколения хозяйственно ценные признаки поддерживаются. Рис. 1. Получение аллофенных мышей 35. Изобразите в виде схемы этапы технологии получения гибридом. Гибридома — гибридная клеточная линия, полученная в результате слияния клеток двух видов: способных к образованию антител B-лимфоцитов, полученных из селезёнки иммунизированного животного, и раковых клеток миеломы. Общая схема получения гибридом на основе миеломных клеток и иммунных лимфоцитов включает следующие этапы: 1. Получение опухолевых клеток, погибающих при последующей селекции гибридомных клеток. ↓ 2. Получение лимфоцитов - продуцентов антител к заданным антигенам. Животное иммунизируют введением антигена в брюшную полость, внутривенно или подкожно. ↓ 3. Слияние лимфоцитов с опухолевыми клетками. Сливающим агентом служит полиэтиленгликоль, реже лизолецитин или вирус Сендай, а также электрическое поле. ↓ 4. Скрининг гибридомных клеток. Применяют селективную среду ГАТ, содержащую гипоксантин, аминоптерин и тимидин. На этой среде родительские миеломные клетки погибают как генетически дефектные по ферментам запасных путей биосинтеза нуклеотидов. Родители-лимфоциты, не слившиеся с миеломными клетками, тоже погибают, поскольку они не способны расти вне организма в заданных условиях. Гибридомные клетки сочетают в себе способность к неограниченному росту и к синтезу нуклеотидов по запасным путям и поэтому накапливаются в культуре. ↓ 5. Проверка способности гибридомных клеток продуцировать моноклональные антитела к заданному антигену. Для этого используют метод иммуносорбентов. Образец культуральной жидкости с гибридомными клетками вводят в реакцию с соответствующим антигеном, прочно закрепленным на носителе. Для распознавания комплекса антиген - антитело к используемым антителам получают вторые антитела путем иммунизации этими иммуноглобулинами животного (например, иммуноглобулины мыши вводят в организм козы). Эти вторые антитела ковалентно связывают с каким-либо ферментом (например, с пероксидазой). Если вырабатываемые гибридомой антитела действительно связывают заданный антиген, то добавление к ним вторых антител с пришитым ферментом ведет к образованию комплекса антиген - моноклональное антитело-антитело к моноклональному антителу - фермент. Последующее добавление субстрата, соответствующего ферменту, запускает ферментативную реакцию, протекание которой регистрируется по образованию ярко окрашенного продукта. ↓ 6. Клонирование гибридомных клеток, прошедших проверку на образование моноклональных антител, с постоянным контролем на стабильность их иммунных свойств. ↓ 7. Массовое культивирование гибридомы, выделение, концентрирование и очистка продуцируемых антител. 36. Изобразите схематично этапы технологии получения моноклональных антител (МАТ). Полностью процедура получения моноклональных антител включает в себя следующие этапы: 1. Иммунизация животных. Для большинства растворимых антигенов можно использовать следующую схему иммунизации. - Вводят 1-100 мкг антигена в ПАФ или в виде преципитата на квасцах внутрибрюшинно. Если есть возможность, то одновременно вводят 2*109 убитых клеток B. Pertussis. - Через 2-3 недели вводят антиген на физиологическом растворе внутрибрюшинно или внутривенно. Эту процедуру можно повторять до появления высокого титра антител. - Последнюю иммунизацию делают внутривенно, через 3 суток животные забиваются, и готовится суспензия клеток для гибридизации. ↓ 2. Слияние. Существуют два основных варианта добавления ПЭГ, используемых в настоящее время. Первый метода заключается в следующем. В течение 1 мин добавляют 1 мл 50% раствора ПЭГ при 370 С с постоянным перемешиванием. Затем раствор постепенно разбавляют до 10 мл в течение нескольких минут средой без сыворотки, после чего клетки центрифугируют и ресуспендируют в среде культивирования. Во втором методе используют более длительную обработку клеток раствором ПЭГ. К осадку клеток добавляется 30-35% ПЭГ при комнатной температуре. Клетки центрифугируют 2 мин, затем их оставляют при комнатной температуре еще на 5-7 мин. Затем их разводят в большом объеме среды с сывороткой, обмывают и культивируют. ↓ 3. Клонирование гибридомных клеток. К основным методам клонирования клеток относятся клонирование методом лимитирующих разведений, клонирование в полужидком агаре и клонирование с помощью прибора – проточного цитофлуориметра. ↓ 4. Массовая наработка моноклональных антител. После отбора гибридомных клеток, синтезирующих интересующие исследователя антитела, можно приступить к их массовому наращиванию с целью получения больших количеств моноклональных антител. Для получения максимальной продукции моноклональных антител клеткам позволяют расти до предельной плотности. В такой культуре через определенное время наблюдается гибель гибридомных клеток. Надосадочная жидкость собирается, а клеточный осадок отбрасывается, то есть не пытаются культивировать дальше оставшиеся живые клетки. Для получения больших количеств антител вводят гибридомные живые клетки в организм животных и получают от них асцитную жидкость. Предварительно животным вводят агенты, повышающие способность гибридом расти в брюшной полости. В качестве такого агента чаще всего выступает пристан – 0,5 мл за 10-14 суток до введения клеток. ↓ 5. Очистка антител. Для многих целей не требуется очистка антител, и они используются в виде культуральных жидкостей или асцитных жидкостей. Грубую иммуноглобулиновую фракцию можно получить высаливанием белков сульфатом аммония с последующим диализом. Если антитела необходимо выделить в чистом виде, то предварительно определяют их класс и подкласс, так как способы очистки различаются для антител разных классов. Это можно сделать с помощью метода иммунодиффузии по Ухтерлони. Выделение чистых антител лучше всего проводить на иммуносорбентах. При этом методе есть опасность, что при фиксации изменяется антигенная структура клеточной поверхности. Если не удается выделить антитела прямым способом, то получают иммуноглобулиновую фракцию с помощью различных методов аффинной и ионообменной хроматографии на сефарозес пришитым ковалентно белком А. 37. Практические аспекты применения моноклональных антител. Моноклональные антитела вырабатывает один клон клеток. Данное явление наблюдается при выращивании В-лимфоцитов в культуре. Известно, что лимфоциты активируются для выработки антител к специфическим мишеням, либо антигенам в случае, когда те связаны с их поверхностями. Благодаря такому связыванию лимфоцит побуждается не только к выработке соответствующих антител, но и к индукции деления клетки, вследствие чего образуются ее клоны. Часть клеток, активированных антигеном в культуре, начинают делиться, образовывая массы, видные даже невооруженным глазом. Это вырабатывающие определенный тип антител клоны. Наблюдаемое в культуре клеток деление определенного типа лимфоцитов может происходить и в человеческом организме. Человеческие моноклональные антитела имеют различные способы применения. Теория позволяет выращивать данные антитела из полученных в лабораторных условиях Влимфоцитов. На практике это сложно, поскольку клоны человеческих В-лимфоцитов довольно трудно поддерживаются в культуре в условиях лаборатории. Более простой путь – воздействие интересующим антигеном на мышей, либо крыс, в результате чего развиваются клоны В-лимфоцитов, которые образуют необходимые антитела. Для коммерческого получения моноклональных антител используют комбинацию клеток мыши, либо крысы с клетками человека. Такую комбинацию называют гибридома. Получение антител посредством гибридом является процессом дорогостоящим и длительным. Поэтому современная биоинженерия научилась получать многие моноклональные антитела, пользуясь клетками яичника китайского хомячка, СНО-клетки. На сегодняшний день, данный вариант признан лучшим в производстве моноклональных антител биоинженерного типа, хотя и он не лишен недостатков. В получаемых данным способом моноклональных антителах фрагментарно присутствуют антигены, распознаваемые организмом человека как чужеродные, следствием чего является их отторжение. Генными инженерами разработан еще один подход, значительно увеличивший терапевтические возможности моноклональных антител. Пользуясь техникой рекомбинантных ДНК, ученые сумели принудить клетки грызунов к выработке антител с человеческими Fc-фрагментами. Провоцирующие процессы отторжения чужеродных антител антигены находятся именно в Fc-фрагментах. Полученные таким способом антитела принято называть химерными. Применение химерным антителам нашли при лечении, преимущественно, раковых (онкологических) и иммунных заболеваний. Следующим шагом было получение «гуманизированных» моноклональных антител, являющих собой антитела грызунов, в которых большая часть структур Fc-фрагмента заменена соответствующими структурами человека, такое стало возможно благодаря успехам генной инженерии. Проводятся испытания полностью человеческих моноклональных антител, некоторые из них успешно применяют в терапии. Среди четырех видов моноклональных антител: химерные антитела, моноклональные антитела грызунов, человеческие и гуманизированные антитела, широко применяются сегодня химерные. Для клинических испытаний чаще всего берут человеческие моноклональные антитела. Управление по лекарствам и питанию США (FDA) одобрило на сегодня 18 типов моноклональных антител. Преимущественно, это химерныем антитела и моноклональные антитела грызунов. Иммунотерапевтический препарат Herceptin применяют для лечения рака груди. Препарат Rituxan является химерным моноклинальным антителом, используется в лечении лимфом. Основными областями применения моноклональных антител является лечение рака и иммуносупрессия, то есть подавление иммунитета. 38. Микробиологическое производство лекарственных средств. В фазе замедления роста и в стационарной фазе некоторые микроорганизмы синтезируют вещества не играющие роли в метаболизме. Эти вещества называют вторичными метаболитами. Их синтезируют не все микроорганизмы, а в основном нитчатые бактерии, грибы и спорообразующие бактерии. Вторичные метаболиты являются биологически активными веществами: одни из них обладают антимикробной активностью, другие являются специфическими ингибиторами ферментов, третьи – ростовыми факторами, многие обладают фармакологической активностью. Получение такого рода веществ послужило основой для создания целого ряда отраслей микробиологической промышленности. Первым в этом ряду стало производство пенициллина; микробиологический способ получения пенициллина был разработан в 1940-х годах и заложил фундамент современной промышленной биотехнологии. Микробиологический процесс получения антибиотика включает в себя следующие основные стадии:1. получение соответствующего штамма — продуцента антибиотика, пригодного для промышленного производства;2. биосинтез антибиотика; 3. выделение и очистка антибиотика; 4. концентрирование, стабилизация антибиотика и получение готового продукта. Это были: циклоспорин – иммунодепрессант, используемый в качестве средства, предотвращающего отторжение имплантированных органов; имипенем (одна из модификаций карбапенема) – вещество с самым широким спектром антимикробного действия из всех известных антибиотиков; ловастатин – препарат, снижающий уровень холестерина в крови; ивермектин – антигельминтное средство, используемое в медицине для лечения онхоцеркоза, или «речной слепоты», а также в ветеринарии. Препараты, производимые для сельского хозяйства, делятся на 3 группы: - энтомопатогенные препараты; - бактериальные удобрения; - антибиотики Биотехнологическое производство выпускает 3 группы энтомопатогенных препаратов: 1. Бактериальные препараты на основе Bacillus thuringiensis - энтобактерин-3, дендробациллин, инсектин, токсобактерин. 2. Грибной препарат боверин на основе гриба Beauveria bassiana. 3. Препараты на основе вирусов ядерного полиэдра (вирин-ЭНШ, вирин-ЭКС и др.). Из всех энтомопатогенных бактерий наиболее исследованы грамположительные бактерии Bac.thuringiensis. Она не только разрушает насекомое, попадая внутрь, но и продуцирует ряд токсичных продуктов. Бактерии Bac. thuringiensis антагонистичны к 130 видам насекомых. Наибольший эффект достигается при применении препаратов этой группы против листогрызущих вредителей. Наиболее распространенные препараты на основе различных вариаций Bac. thuringiensis: энтобактерин, инсектин, алестин, экзотоксин, токсобактерин, дендробациллин, битоксибациллин. Промышленное производство энтомопатогенных бактерий заключается в глубоком культивировании. При этом ставится задача получения максимального титра клеток в культуральной жидкости и накопления токсина. Требования к промышленным штаммам энтомопатогенных бактерий: принадлежность штамма к определенному серотипу, высокая вирулентность и продуктивность на промышленных средах, устойчивость к комплексу фагов и т.д. 39. Технологии создания и производства антибиотиков (на примере промышленного производства гентамицин сульфата). 1. Приготовление посевного материала на агаризованной питательной среде (культура Micromonospora purpurea var.violacca на агаризованной среде Гаузе1). 2. Выращивание вегетативного посевного материала в колбах (выращивание посевного материала первой генерации). 3. Выращивание посевного мицелия в биоректорах (выращивание посевного материала 2ой генерации в посевном биореакторе для глубинного культивирования). 4. Биосинтез гентамицина (культивирование методом периодического глубинного культивирования в течении 6-7 сут. Режимы культивирования меняются в процессе роста мицелия: 0-24 ч. Темп-ра от 37 оС понижается к концу культивирования до 33 о С. Расход воздуха на аэрацию и частота вращения мешалки в первые 24ч.=75 дм3/мин и 3,5 об/мин и повышается к середине цикла культивирования до 105 и 4,16 соответственно, затем снижается до начальных занчений). 5. Предварительная обработка (р-ром щавелевой к-ты, цетилпиридиний бромидом для коагуляции белков и удаления поливалентных металлов)и ультрафильтрация культуральной жидкости гентамицина (пропускание раствора через мембранный фильтр для очистки от НМС). 6. Сорбция гентамицина на КБ-2 катионите в аммонийной форме и десорбция (химическая очистка: сорбция гентамицина из нативного р-ра, вымывание минорных компонентов с помощью 0,043Н р-ром аммиака, десорбция гентамицина 5% р-ром аммиака). 7. Получение концентрата гентамицина (элюат гентамицина упаривают на роторном испарителе при темп-ре 50-55 0 С и Р=0,085МПа для удаления аммиака и концентрирования гентамицина до 70000 мкг/см3. 8. Осветление концентрата гентамицина основания углем и перевод его в сульфат форму (очищенный концентрат гентамицина основания подкисляют 20% серной к-той до рН6,+активированный уголь (7% от объема концентрата) и нагревают до 40-45 0С в теч.30 мин., уголь отфильтровывают). 9. Распылительная сушка водных растворов гентамицина сульфата (с помощью сушки для распылительного обезвоживания р-ров. Осушителем явл-ся нагретый до 103-185 0С воздух. 10. Фасовка, упаковка, маркировка препарата гентамицина сульфата. 40. Использование в биотехнологии цианобактерий и микроводорослей. Цианобактерии и микроводоросли обладают рядом преимуществ: легко культивируются, более высокая скорость роста, возможность получения синхронизированных культур, развитие большого количества разнообразных методов молекулярной генетики и микробиологии для различных штаммов цианобактерий и водорослей. Эти методы позволяют глубже понять роль объектов в различных экосистемах; использовать их потенциал в разнообразных прикладных проектах, таких, как получение молекулярного водорода; продукция фикобилипротеинов и цианофицина; формирование наночастиц; удаление из окружающей среды тяжелых металлов; использование биодеградирующих способностей цианобактерий; изучение проблем образования цианобактериальных токсинов в пресных водоемах и морских акваториях; применение природных продуктов, получаемых из цианобактерий, в медицине и в пищевой индустрии. Использование информации о геномных последовательностях цианобактерий в сочетании с транскриптомикой, протеомикой и метагеномикой позволит глубже понять ключевые аспекты биологии этих удивительных организмов и использовать их еще более эффективно при решении задач экологии и биотехнологии. Все цианобактерии обладают способностью к азотфиксации, что делает их весьма перспективными продуцентами белка. Анабена (Anabaena) - нитчатая синезеленая водоросль. В цитоплазме клеток откладывается близкий к гликогену запасной продукт - анабенин. Такие представители цианобактерий, как носток, спирулина, триходесмиум съедобны и непосредственно употребляются в пищу. Носток образует на бесплодных землях корочки, которые разбухают при увлажнении. Спирулину давно используют в пищу народы Африки. Для белков этой водоросли характерно сбалансированное содержание аминокислот. Клеточная стенка этой водоросли хорошо переваривается. Недавно было показано, что в клетках спирулины, помимо ценного белка, углеводов, липидов, витаминов, в значительных количествах запасается, например, такое ценное вещество, как поли-b-оксибутират. Отечественная фармацевтическая промышленность выпускает препарат «Сплат» на основе цианобактерии Spirulina platensis. Он содержит комплекс витаминов и микроэлементов и применяется как общеукрепляющее и иммуностимулирующе средство. 41. Изобразите схематично этапы технологии клонирования животных. Клонирование животных. Из овцы извлекают ооциты и помещают их в искусственную питательную среду с добавление эмбриональной телячьей сыворотки при температуре 37˚С и проводят операцию энуклеации. Используют разные клетки донора, которые выводят из стадии роста клеточного цикла, разбавляя сыворотку, через 5 дней сливают с энуклеированным ооцитом. Активируют к развитию посредством электрического удара. Развивающийся зародыш культивируют в течение 6 дней в искусственной химической среде или яйцеводе овцы. На стадии морулы ил бластоцисты эмбрионы трансплантируют в матку приемной матери, где они развиваются до рождения. 42. Изобразите схематично этапы технологии клонирования растений. У растения берут какую-нибудь ткань, например, кусочек корнеплода моркови, помещают в колбу или пробирку с плотной питательной средой, добавляют гормоны роста. Через некоторое время клетки теряют признаки прежней дифференцировки и приступают к размножению. В это время клетки можно рассадить по одной штуке в множество колб или пробирок, и процесс пойдет с прежним темпом в каждой из них образуется каллус, в которой далее идет дифференциация по разным тканям, формируются органы: корень, стебель, листья и в конце концов цветки. Растение в пробирке готово. Таким образом удается вырастить стерильный, не пораженный вирусами или бактериями, посадочный материал. 43. Клонирование гена (ПЦР) и генная терапия. Клонирование генов — процесс выделения заданной последовательности ДНК и получения многих её копий in vitro. Клонирование ДНК часто применяют для амплификации фрагментов, содержащих гены, а также любые другие последовательности — например, промоторы, некодирующие последовательности, химически синтезированные олигонуклеотиды и случайные участки ДНК. В методиках рестрикции и лигирования, клонирование фрагмента ДНК включает четыре стадии: разрезание ДНК эндонуклеазами рестрикции, лигирование ДНК с вектором, трансфекция и последующий скрининг (отбор).Выделение вставки. Сначало выделяют участок ДНК для клонирования. Препарат ДНК для клонирования получают при помощи полимеразной цепной реакции, а также разрезания ДНК рестриктазами, обработкой ДНК ультразвуком, фракционированием при помощи агарозного электрофореза ДНК. Трансформация.После лигирования плазмидой трансформируют бактерии для наращивания. Бактерии выращивают на селективной среде для отбора колоний, содержащих встройку. Индивидуальные колонии отбирают и изучают на наличие встройки. Трансфекция. После лигирования реакционную смесь со встроенным в требуемой ориентации вектором помещают в клетки. В зависимости от типа клеток используют химическую сенситизацию клеток, электропорацию или генные пушки. Для химической сенситизации не требуется специальное оборудование. Электропорацию используют в случае необходимости высокой эффективности трансфекции. Генные пушки применяют в случае растительных клеток и тканей, так как клеточная стенка растений не дает чужеродной ДНК проникать в цитоплазму и ядро. Отбор. Получают культуры трансфецированных клеток. Эти процедуры имеют низкую эффективность, поэтому требуются способы выявления клеток, содержащих требуемую вставку в правильной ориентации и отделение таких клеток от не содержащих вставки. Современные векторы для клонирования содержат селективные маркеры (гены устойчивости к антибиотикам), которые дают возможность расти только клеткам с правильной вставкой, расти на селективной среде (с антибиотиком). Векторы для клонирования содержат маркеры, обуславливающие окраску колоний. Для точного подтверждения успешного клонирования, требуется проверка при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР), полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) илисеквенирования ДНК. Генная терапия - введение работающего гена в клетки, в которых он отсутствует, что приводит к излечению болезни, связанной с отсутствием или неправильным функционированием гена. Генную терапию классифицируют на две категории. В первом - мутации содержатся в стволовых или половых клетках, тогда весь организм и все потомки имеют дефект. Во втором случае мутация возникает в соматических клетках, возможна пересадка модифицированных клеток или тканей. Клинические испытания генной терапии соматическими клетками начались в конце 1990-х, для лечения рака крови, печени и легких. 44. Культура стволовых клеток. Применение в медицине. Стволовые клетки- прород-цы всех типов клеток в организме-обновляют и замещают клетки,утраченные в организме.По своему происхождению различают:эмбриональные,фетальные,стволовые клетки пуповин.крови, стволовые клетки взрослого человека.Источником эмбрион-х стволовых клеток яв-ся бластоцистазародыш,который форм-ся к пятому дню оплодот-ия. Фетальные стволовые клетки получают из абор-го материала на 9-12 неделе.Источником стволовых клеток также яв-ся пуповинная кровь,собранная после рождения ребенка. Самым доступным источником ствол.клеток яв-ся мозг человека,в котором выделяют 2 вида стволовых клеток: гемапоэтический-из них формируются все клетки крови, мезенхимальные- могут трансформироваться в клетки различных органов и тканей. Эмбриональные стволовые клетки - тип плюрипотентных клеток млекопитающих, поддерживаемых в культуре. Получают из внутренней клеточной массы бластоцисты на ранней стадии развития зародыша. Зародыш человека достигает стадии бластоцисты спустя 5-6 дней после оплодотворения, бластоциста человека состоит из 50-150 клеток. Плюрипотентность означает, что они могут дифференцироваться во все три первичных зародышевых листка: эктодерму, энтодерму и мезодерму. Т.о. образуются более 220 видов клеток. Стволовые клетки спинного мозга используются для терапии различных заболеваний, в том числе онкологических, юношеский диабет, синдром Паркинсона, слепота и нарушения работы спинного мозга. Для дифференциации ЭСТ достаточно подействовать на них факторами роста. Например, ЭСТ, дифференцированные in vitro в нейральные клетки, были использованы для восстановления повреждённого спинного мозга крысы. Выделение и культура in vitro Стволовые клетки были выделены при анализе тератокарциномы. В 1964 году исследователи показали, что клетки тератокарциномы остаются недифференцированными в культуре клеток. Такие стволовые клетки называют эмбриональными клетками карциномы. Исследователи показали, что первичные эмбриональные зародышевые клетки могут размножаться в культуре и могут образовывать разные типы клеток. Культивирование новой линии стволовых клеток в среде, полностью свободной от клеток и сыворотки животного происхождения после более чем шестимесячного периода культивирования в недифференцированном состоянии эти клетки могли дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых листков как в составе тератом, так и в культуре. Индуцированные плюрипотентные стволовые (iPS) клетки удалось получить из клеток различных тканей (фибробластов) с помощью их перепрограммирования методами генетической инженерии. В ранних работах их пытались получить путём слияния «взрослых» клеток с ЭСК. В 2008 г были разработаны методы перепрограммирования клеток путем введения в них «эмбриональных» с помощью аденовирусов и других векторов. При этом выяснилось, что перепрограммирование может индуцироваться временной экспрессией введённых генов, без их встраивания в геном клеток. Так же была опубликована работа, в которой с помощью метода тетраплоидной комплементации впервые было показано, что iPS могут давать полноценный организм, в том числе и его клетки зародышевого пути. iPS, полученные из фибробластов кожи мышей с помощью трансформации с использованием ретровирусного вектора, в некотором проценте случаев дали здоровых взрослых мышей, которые были способны нормально размножаться. Т.о., впервые были получены клонированные животные без примеси генетического материала яйцеклеток (при стандартной процедуре клонирования митохондриальная ДНК передается потомству от яйцеклетки реципиента). 45. Способы получения иммобилизованных клеток и ферментов. Термин «иммобилизованные ферменты» означает любое ограничение свободы передвижения белковых молекул в пространстве. Сущность иммобилизации ферментов — прикрепление их в активной форме к нерастворимой основе или заключение в полупроницаемую мембранную систему. Прикрепление фермента к носителю осуществляется адсорбционно, химической связью или путем механического включения фермента в органический или неорганический гель. Существует два основных метода иммобилизации ферментов: физический и химический. Физическая иммобилизация ферментов представляет собой включение фермента в такую среду, в которой для него доступной является лишь ограниченная часть общего объема. При физической иммобилизации фермент не связан с носителем ковалентными связями. Существует четыре типа связывания ферментов: адсорбция на нерастворимых носителях; включение в поры геля; пространственное отделение фермента от остального объема реакционной системы с помощью полупроницаемой перегородки (мембраны); включение в двухфазную среду, где фермент растворим и может находиться только в одной из фаз. Преимущества иммобилизованных ферментов перед нативными предшественниками: 1. Гетерогенный катализатор легко отделим от реакционной среды, что дает возможность остановить реакцию в любой момент, использовать фермент повторно, а также получать чистый от фермента продукт. 2. Ферментативный процесс с использованием иммобилизованных ферментов можно проводить непрерывно, регулируя скорость катализируемой реакции и выход продукта. 3. Модификация фермента целенаправленно изменяет его свойства, такие как специфичность, зависимость каталитической активности от рН, ионного состава и других параметров среды, стабильность к денатурирующим воздействиям. 4. Можно регулировать каталитическую активность иммобилизованных ферментов путем изменения свойств носителя действием физических факторов, таких как свет и звук. Для получения иммобилизованных ферментов используется ограниченное число как органических, так и неорганических носителей. К носителям предъявляются следующие требования: 1. высокая химическая и биологическая стойкость; 2. высокая химическая прочность; 3. достаточная проницаемость для фермента и субстратов, пористость, большая удельная поверхность; 4. возможность получения в виде удобных в технологическом отношении форм (гранул, мембран); 5. легкая активация; 6. высокая гидрофильность; 7. невысокая стоимость. Для иммобилизации ферментов наиболее широко используются природные полисахариды и синтетические носители полиметильного типа, остальные применяются значительно реже. Большое значение природных полимеров в качестве носителей для иммобилизации объясняется их доступностью и наличием реакционно-способных функциональных групп, легко вступающих в химические реакции. Характерной особенностью этой группы носителей также является их высокая гидрофильность. Недостаток природных полимеров неустойчивость к воздействию микроорганизмов и довольно высокая стоимость. Наиболее часто для иммобилизации используются такие полисахариды, как целлюлоза, декстран, агароза и их производные. Иммобилизованные клетки имеют ряд преимуществ как перед иммобилизованными ферментами, так и перед свободными клетками: - отсутствие затрат на выделение и очистку ферментов; - снижение затрат на выделение и очистку продуктов реакции; - более высокая активность и стабильность; - возможность создания непрерывных и полунепрерывных автоматизированных процессов; - способность к длительному функционированию полиферментных систем без экзогенных кофакторов. Для иммобилизации могут быть использованы клетки в различном состоянии: живые и поврежденные в различной степени. Одностадийные реакции могут осуществлять и живые, и поврежденные клетки. Полиферментные реакции проводят с применением живых клеток, которые могут длительное время регенерировать АТФ и коферменты (НАДФ, НАД). Проблема использования ферментативной активности иммобилизованных микроорганизмов имеет глубокие корни. Более 150 лет назад быстрый способ получения уксуса был основан на применении микроорганизмов, адсорбированных на древесной стружке. Методы иммобилизации клеток схожи с методами иммобилизации ферментов. 46. Клеточная селекция. Клеточная селекция предполагает отбор естественных или индуцированных мутантов in vitro на клеточном уровне, регенерацию из них растений и идентификацию мутаций в R0 –потомстве. Для отбора клеток с желательными признаками используют селективные среды, в основном обеспечивающие системы резистентности к стрессовым воздействиям. Выделяют следующие приемы для отбора мутантных клеток: 1.Прямая (позитивная) селекция, при которой выживает определенный мутантный тип клеток; 2. Непрямая (негативная) селекция, основанная на избирательной гибели делящихся клеток дикого типа и выживании метаболически неактивных клеток, но требующая дополнительной идентификации у них мутационных изменений; 3.Тотальная селекция, при которой индивидуально тестируются все клеточные клоны; 4.Визуальная селекция и неселективный отбор, когда мутантная линия может быть идентифицирована среди всей популяции клеток визуально или при использовании биохимических маркеров. Наиболее распространенной является прямая селекция, основанная на отборе клеток с желаемыми признаками на устойчивость к стрессовым воздействиям ( патогены, гербициды, засоление, неоптимальная температура, высокие или низкие значения рН, тяжелые металлы и др.). Как правило , селективные агенты добавляют в состав питательной среды . Для выделения сомаклонов, устойчивых к патогенам , используют среду с токсином, выделяемым патогеном или с культуральной жидкостью, в которой развивался патоген. Для создания форм, устойчивых к засолению, в состав питательной среды добавляют соли Na Cl, Na2 SO4.Для отбора форм с повышенным содержанием незаменимых аминокислот в среду добавляют их токсические аналоги. При этом происходит накопление в клетке основной аминокислоты. Схему прямой селекции мутантов можно представить следующим образом: 1.Выделение каллуса, протопластов или суспензионной культуры; 2. Возникновение спонтанной сомаклональной изменчивости в культуре клеток, или ее индуцирование химическими или физическими мутагенами; 3. Культивирование клеток в неселективных условиях; 4. Культивирование клеток на селективных средах (отбор клеточных вариантов); 5. Культивирование колоний клеток на регенерационных средах; 6. Регенерация растений и их размножение (проведение тестов на устойчивость, биохимические анализы); 7.Высадка растений в почву ( тестирование на устойчивость семян , изучение генетической природы устойчивости). Клеточная селекция растений во многом напоминает селекцию микроорганизмов, и, несмотря на определенные трудности , имеет ряд преимуществ перед традиционными методами отбора:возможность оперировать с миллионами клеток;направленный характер селекции благодаря использованию селективного фона;возможность перенесения процедуры отбора в лабораторные условия, отсутствие сезонности в работе, контролируемые условия эксперимента и воспроизводимость результатов. Эффективность отбора связана с большим количеством материала, который может быть оценен в условиях in vitro. Например, за один прием можно протестировать около 20 млн клеток, выделенных из листьев картофеля, при этом каждая клетка — отдельный генотип. Существующие методы культивирования изолированных клеток и тканей in vitro условно можно разделить на две группы. Первая группа — это вспомогательные технологии, которые не подменяют обычную селекцию, а служат ей. К ним можно отнести: оплодотворение in vitro (преодоление прогамной несовместимости), культивирование семяпочек и незрелых гибридных зародышей (преодоление постгамной несовместимости), получение гаплоидов путем культивирования пыльников и микроспор, криосохранение изолированных клеток, тканей и органов, клональное микроразмножение отдаленных гибридов. Вторая группа методов ведет к самостоятельному, независимому от традиционных методов селекции, получению новых форм и сортов растений: клеточная селекция с использованием каллусной ткани, соматическая гибридизация (слияние изолированных протопластов и получение неполовых гибридов), применение методов генной инженерии. В отдаленной гибридизации находят применение такие методы культуры изолированных тканей, как оплодотворение in vitro, эмбриокультура (выращивание изолированных зародышей на искусственных питательных средах), клональное микроразмножение ценных гибридов, а также получение гаплоидов in vitro и криосохранение. 47. Использование клеточных бт в медицине. В медицине биотехнологические приемы и методы играют ведущую роль при создании новых биологически активных веществ и лекарственных препаратов, предназначенных для ранней диагностики и лечения различных заболеваний. Антибиотики — самый большой класс фармацевтических соединений, получение которых осуществляется с помощью микробиологического синтеза. Созданы генноинженерные штаммы кишечной палочки, дрожжей, культивируемых клеток млекопитающих и насекомых, используемые для получения ростового гормона, инсулина и интерферона человека, различных ферментов и противовирусных вакцин. Изменяя нуклеотидную последовательность в генах, кодирующих соответствующие белки, оптимизируют структуру ферментов, гормонов и антигенов (так называемая белковая инженерия). Важнейшим открытием явилась разработанная в 1975 Г. Келером и С. Мильштейном техника использования гибридом для получения моноклональных антител желаемой специфичности. Моноклональные антитела используют как уникальные реагенты, для диагностики и лечения различных заболеваний. 48. Использование клеточных бт в сельском хозяйстве. Вклад биотехнологии в сельскохозяйственное производство заключается в облегчении традиционных методов селекции растений и животных и разработке новых технологий, позволяющих повысить эффективность сельского хозяйства. Во многих странах методами генетической и клеточной инженерии созданы высокопродуктивные и устойчивые к вредителям, болезням, гербицидам сорта сельскохозяйственных растений. Разработана техника оздоровления растений от накопленных инфекций, что особенно важно для вегетативно размножаемых культур (картофель и др.). Как одна из важнейших проблем биотехнологии во всем мире широко исследуется возможность управления процессом азотфиксации, в том числе возможность введения генов азотфиксации в геном полезных растений, а также процессом фотосинтеза. Ведутся исследования по улучшению аминокислотного состава растительных белков. Разрабатываются новые регуляторы роста растений, микробиологические средства защиты растений от болезней и вредителей, бактериальные удобрения. Генноинженерные вакцины, сыворотки, моноклональные антитела используют для профилактики, диагностики и терапии основных болезней сельскохозяйственных животных. В создании более эффективных технологий племенного дела применяют генноинженерный гормон роста, а также технику трансплантации и микроманипуляций на эмбрионах домашних животных. Для повышения продуктивности животных используют кормовой белок, полученный микробиологическим синтезом. 49. Использование клеточных технологий в экологии. Биоконверсия лигноцеллюлозных отходов: Растительная биомасса - возобновляемый и легкодоступный источник сырья. Основные ее компоненты - целлюлоза (2/3), крахмал, гемицеллюлоза, лигнин. Лигнин - высокомолекулярный нерастворимый трехмерный неупорядоченный ароматический полимер. Целлюлоза высокомолекулярный нерастворимый полимер глюкозы. Она является главным компонентом как растительной биомассы, так и сельскохозяйственных, бытовых отходов, а также отходов деревообрабатывающей и целлюлозно-бумажной промышленности. В основе биологической деградации лигноцеллюлозы лежит действие целлюлолитических ферментов. Реакционная способность природных целлюлозосодержащих материалов невелика, поэтому сырье для ферментативного осахаривания целлюлозы должно иметь большую поверхность, а микрофибриллярная структура целлюлозы должна быть разрушена. Наиболее эффективным, а также дорогим и энергоемким способом предварительной подготовки сырья является размол. Биодеградация ксенобиотиков: В удалении ксенобиотиков из окружающей среды важны несколько факторов: устойчивость ксенобиотиков к различным воздействиям; растворимость их в воде; летучесть ксенобиотиков; рН среды; способность ксенобиотиков поступать в клетки микроорганизмов; сходство ксенобиотиков и природных соединений, подвергающихся естественной биодеградации. Для биодеградации ксенобиотиков лучше использовать ассоциации микроорганизмов, так как они более эффективны, чем отдельно взятые виды. При этом типы связей в подобной ассоциации могут быть различны. Один вид микроорганизмов может непосредственно участвовать в разложении ксенобиотиков, а другой – поставлять недостающие питательные вещества. Это может быть метаболическая «атака» на субстрат, когда синтезируются разные компоненты ферментативного комплекса, или же цепочка ферментативных реакций (многосубстратные конверсии) и т.д. Особенно трудно разлагаются такие биоциды, как детергенты, пластики и углеводороды. Самыми способными к борьбе с загрязнителями различного типа являются представители рода Pseudomonas – они практически «всеядны». Клетки этих микроорганизмов содержат оксидоредуктазы и гидроксилазы, способные разлагать большое число молекул углеводородов и ароматических соединений, таких как бензол, ксилол, толуол. 50. Безотходная технология производства биогаза. Биогаз-это смесь из метана,углекислого газа, сероводорода и незначительных примемсей азота,кислорода,водорода и угарного газа. В основе получения биогаза лежит процесс метанового брожения, или биометаногенез. Биометаногенез-микробиологический процесс ,в котором органическое вещество разлагается до диокстида углерода и метана в аэробных условиях. Микробиологическому анаэробному разложению поддпаются все соед-ия природного происхождения. В анаэробном процессе биометаногенеза выделяют 3 стадий. На первой стадий под влиянием ферментов ферментативному гидролизу подвергаются сложные соединения: белки,липидыи полисахариды. Вместе с гидролитическими бактериями функционируют и микроорганизмы- бродильщики. На второй стадий (ацидогенез) в процессе ферментаций участвуют две группы микроорганизмов:ацитогенные и гомоацитогенные. Ацитогенные водородпродуцирующие микроорганизмы ферментируют моносахараспирты и органические кислоты с образованием водорода,углекислого газа, кислот,в основном ацетат. Гомоацетатные микроорганизмы усваивают водород и углекислый газ, а также некоторые одноуглеродные соединения через стадию образования ацетил-коэнзим А и превращения его в низкомолекулярные кислоты. На заключительной стадий анаэробного разложения отходов образуется метан. Он может синтезироваться через стадию восстановления СО2,молекулярным водородом. Особое место в утилизаций отходов занимает метановое брожение . Оно позволяет получать из местного сырья биогаз как локальный источник энергий,а также улучшать качество органического удобрения и защищать от загрязнения окружающую среду. Производство биогаза путем метанового «брожения» отходов — одно из возможных решений энергетической проблемы в большинстве сельских районов развивающихся стран. 51. Методы клонирования растений. Клональное микроразмножение-бесполовое размножение в культуре тканей и клеток,при котором возникшие растения генетически идентичны исходному экземпляру. Иначе клонирование можно определить как процесс изготовления генетически идентичных копий отдельной клетки или организма. То есть полученные в результате клонирования организмы похожи не только внешне, но и генетическая информация, заложенная в них, абсолютно одинакова. Клонирование организмов может быть полным или частичным. При полном клонировании воссоздаётся весь организм целиком, а при частичном - воссоздаются лишь те или иные ткани организма. Этот метод имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения: получение генетически однородного посадочного материала; освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры; высокий коэффициент размножения (105 - 106 - для травянистых, цветочных растений, 104 105 - для кустарниковых древесных растений и 104 - для хвойных);сокращение продолжительности селекционного процесса;ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;возможность проведения работ в течение всего года; возможность автоматизации процесса выращивания. Этапы размножения:Выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры.2. Собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества меристематических клонов. 3. Укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям. 4. Выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле. Методы микроклонального размножения: Активация уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля).Индукция возникновения почек или эмбриоидов de novo:образование адвентивных побегов непосредственно тканями экспланта; индукция соматического эмбриогенеза; дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани. Основной метод - активация развития уже существующих в растении меристем. Есть 2 пути: Удаление верхушечной меристемы стебля и последующее микрочеренкование побега in vitro на безгормональной среде. Добавление в питательную среду веществ цитокининового типа действия (Ц), индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов. Клонирование растений осуществляется путем регенерации целого растения из каллуса путем изменения пропорционального соотношений цитокининов и ауксинов в питательной среде. Для получения первичного каллуса можно использовать любые клетки и ткани растения. Но чаще используют для этой цели клетки меристемы ввиду их малой степени дифференциации. В питательную среду для каллусообразования обязательно входят ауксин (для дедифференциации клеток) и цитокинин (для индукции клеточных делений).. Клонирование растений позволяет получать безвирусный посадочный материал (при использовании апикальной меристемы как источника клеток), быстрого размножения растений в больших масштабах (в том числе редких и исчезающих), позволяет получить гомозиготные по всем генам растения, которые можно использовать в дальнейшей селекции. 52. Технологии оздоровления растений: культура апикальных меристем. Многие полезные растения настолько инфицированы вирусными, бактериальными и грибными болезнями, что это приводит ежегодно к резкому снижению урожая и ухудшению качества продукции. Клональное микроразмножение растений, осуществляемое стерильными эксплантами в асептических условиях, приводит к оздоровлению от бактериальных и грибных патогенов, однако от вирусной инфекции поверхностной стерилизацией материала освободиться нельзя. Бороться с вирусными болезнями привычными химическими методами невозможно, так как жизнедеятельность вирусов тесно связана с метаболизмом клетки растения-хозяина. Основной путь борьбы с вирусными болезнями — получение здорового посадочного материала. В последнее время для получения безвирусных растений картофеля и многих других вегетативно размножаемых культур успешно применяется метод культуры апикальных меристем в сочетании с термообработкой, хемотерапией и тестированием на наличие вирусов. Нет единого мнения о причинах слабой репродукции вирусов в меристемных тканях. При тепловой обработке размножение вирусов в развивающейся верхушке побегов так сильно тормозится, что при дифференциации меристемы возможно появление клеток, свободных от вирусов. Для успеха тепловой обработки необходимо выдерживать донорные растения при высокой температуре (34-40°С) в оптимальном для роста состоянии как можно дольше, чтобы получить прирост, свободный от вирусов. Однако не все растения выдерживают длительную тепловую обработку, что приводит к отставанию в росте и другим нарушениям у меристемных растений. У полевых и плодоовощных культур оздоровление проводится при комплексном применении термообработки, культуры меристемы и отбора на основе вирусных тестов. 53. Использование рекомбинантных микроорганизмов для получения коммерческих продуктов (ферментов, гормонов, витаминов и т.д.). Промышленная микробиология с использованием ГМ микроорганизмов развивается в основном по следующим направлениям: 1) производство продуктов биосинтеза трансгенных микроорганизмов, например, антибиотиков, гормонов, ферментов и витаминов; 2) использование биомассы микроорганизмов – производство медицинских вакцин, различных дрожжей, белково-витаминных концентратов и заквасок для получения кисломолочных продуктов и силосования кормов; 3) биотехнологии, основанные на способностях некоторых бактерий производить органические кислоты, этанол, углеводы и метан. В настоящее время биотехнология на основе использования трансгенных микрорганизмов позволяет выпускать в достаточных количествах широкий спектр лекарственных средств,которые раньше были малооступны. К самому большому классу лекарств, получаемых путем микробного синтеза, относятся антибиотики. По разнообразию и показаниям к применению они занимают первое место среди продукции мировой фармацевтической промышленности. Сегодня известно более 6 000 видов антибиотиков. Вторым классом лекарственных препаратов, производимых биотехнологическим путем в микроорганизмах, являются гормоны. В медицинских целях применяются два основных типа гормонов: стероидные и пептидные. Среди стероидных гормонов можно выделить кортизон и преднизолон, которые широко используют при лечении различных аллергических заболеваний.Другой группой стероидов являются половые гормоныэстроген. Особое место среди лекарственных средств занимают ферменты. Ферменты используются – для лечения самых различных патологий: протеазы и липазы – для коррекции пищеварения; протеазы – для удаления некротических тканей, протеиназы с фибринолитическим действием – для растворения тромбов, а антикоагулянты, например плазмин, эффективны при лечении инфаркта миокарда и многие другие. Важный вклад микробной трансгенной биотехнологии в медицину состоит в получении профилактических препаратов, в первую очередь это производство вакцин против различных инфекций. Кроме этого широко в животноводстве и растениеводстве используется около 100 биопрепаратов, таких как стимуляторы роста животных и растений, энтомопатогены и ГМ бактериальные удобрения. дифицированные микроорганизмы. Также в последнее время широко используются трансгенные микроорганизмы используют для производства витаминов и аминокислот, используемых в качестве продуктов питания или добавок к рациону. Примером является производство каротиноидов. Также ГМ -микроорганизмы применяют в производстве продуктов питания. В 1993 г. в Великобритании ГМ-дрожжи получили официальное одобрение для использования в пивоваренной промышленности. К другим микроорганизмам, использующимся для производства продуктов питания, относятся сбраживающие культуры для хлебопечения и пивоварения и молочнокислые бактерии, применяемые при производстве сыра. 54. Биодеградация токсичных соединений и утилизация биомассы. В настоящее время разработан целый ряд технологических, в том числе и биотехнологических, подходов, с помощью которых удастся перерабатывать большие количества отходов (например, лигноцеллюлозы) и токсичные вещества. В 80-е годы мировое производство лишь одного пентахлорфенола составило более 50 000 т. Раньше токсичные вещества разрушали, сжигая их или обрабатывая другими химическими веществами, что тоже приводило к загрязнению окружающей среды, а кроме того, обходилось очень дорого. К середине 60-х гг. были обнаружены почвенные микроорганизмы, способные к деградации ксенобиотиков (неприродных, синтетических химических веществ) – гербицидов, пестицидов, хладагентов, растворителей и т. д. Это открытие подтвердило правильность предположения о том, что микроорганизмы можно использовать для экономичного и эффективного разрушения токсичных химических отходов. Некоторые микроорганизмы обладают природной способностью к деградации различных ксенобиотиков. Но: 1) ни один из них не может разрушать все органические соединения; 2) некоторые органические соединения в высокой концентрации подавляют функционирование или рост деградирующих их микроорганизмов; 3) большинство очагов загрязнения содержит смесь химикатов, и микроорганизм, способный разрушать один или несколько её компонентов, может инактивироваться другими компонентами; 4) многие неполярные соединения адсорбируются частицами почвы и становятся менее доступными; 5) биодеградация органических соединений часто происходит довольно медленно. Часть этих проблем можно решить, осуществив конъюгационный перенос плазмид, которые кодируют ферменты разных катаболических путей, в один реципиентный штамм. Основную группу почвенных микроорганизмов, разрушающих ксенобиотики. составляют бактерии рода Pseudomonas. Биохимические исследования показали, что разные штаммы Pseudomonas способны расщеплять более 100 органических соединений. В биодеградации сложной органической молекулы обычно участвуют несколько разных ферментов. Кодирующие их гены могут иметь хромосомную локализацию, но чаще входят в состав крупных плазмид, а иногда обнаруживаются как в хромосомной, так и в плазмидной ДНК. 55. Микробные инсектициды. Получение и применение. Микробные инсектициды — вещества, уничтожающие насекомых-вредителей с.-х. растений. Для получения микробных инсектицидов используются вирусы, грибы, простейшие, наиболее удобны - спорообразующие бактерии. Микробные инсектициды высоко специфичны и действуют только на определенные вредные насекомые, оставляя невредимыми полезные. Патогенность микроорганизмов вызвана действием определенных токсинов, поэтому выработки устойчивости к биопрепаратам у насекомых не происходит. Микробные пестициды (энтомопатогенные препараты на основе бактерий, грибов или вирусов) подвержены биодеградации. Микроорганизмы могут регулировать рост растений и животных, подавлять заболевания. Некоторые бактерии изменяют кислотность и соленость почвы, другие продуцируют соединения, связывающие железо, третьи вырабатывают регуляторы роста. Как правило, микроорганизмами инокулируют семена и или растения перед посадкой. В животноводстве биотехнология также находит применение. Это диагностика, профилактика, лечение заболеваний с использованием техники моноклональных антител, генетическое улучшение пород животных. Широко используются биотехнологические методы для искусственного осеменения. Биотехнология применяется для силосования кормов, позволяя повышать усвоение растительной биомассы, для утилизации отходов животноводческих ферм и получения экологически чистых органических удобрения на основе переработки отходов растениеводства и животноводства. Некоторые вещества, полученные с помощью микроорганизмов могут использоваться в виде кормовых добавок, другие - подавляют вредную микрофлору в желудочно-кишечном тракте или стимулируют образование специфических микробных метаболитов (кормовые антибиотки, которые используются все шире). 56. Векторные системы, применяемые в генетической инженерии. Вектор – это молекула ДНК, способная к включению чужеродного ДНК и к автономной репликации, служащей для введения генетической информации в клетку. Требования к векторам: 1. вектор должен иметь точку чувствительную к определенной рестриктазе, в которой после расщепления встраиваются чужеродные гены. 2. вектор должен реплицироваться, то есть размножаться в определенной клетке. 3. должен иметь маркерный ген, который после проникновения вектора в клетку, придают ей фенотип, свидетельствующий о присутствии вектора. Векторные системы, применяемые в генетической инженерии. 1. Плазмиды – автономно существующие кольцевые внехромосомные молекулы ДНК, способные самостоятельно реплицироваться в клетке (содержат гены репликации и устойчивости к антибиотикам в качестве селективных маркеров). Для получения вектора молекулы плазмидной ДНК укорачивают, вводят маркеры для селекции, промотры. Плазмида, испольуемая в качестве вектра, должна имеет 3 характеристики: иметь сайт ori(участок инициаций репликаций) для нормальной репликаций ДНК и размножения плазмидвы в клетке, доминантный селективный маркер, который позволяет отобрать клетку,несущую плазмиду с встроенным фрагментом чужеродной ДНК, иметь сайт рестрикций. Природные плазмиды часто содержат гены, полезные для бактерий: придающие устойчивость к антибиотикам . Например, широко используемый плазмидный вектор рBR322 создан на основе плазмиды E.coli. Плазмида рBR322 имеет сайт ori (область, ответственную за репликацию плазмиды), гены устойчивости к антибиотикам ампициллину (Ap′) и тетрациклину (Tc′). В гене TC′ имеется уникальный сайт, разрезаемый рестриктазой Bam HI. В плазмидах можно клонировать фрагменты ДНК размером не более 10 тпн. 2. Космиды – это плазмиды, которые содержат cos-сайты фага . Космиды могут быть упакованы в фаговый капсид и использованы для инфекции бактерий, в которых они размножаются как обычные плазмиды. Преимущество космид – могут включать больший фрагмент чужеродной ДНК, чем плазмиды. Космида имеет последовательность ori, позволяющая репликацию в клетке, селективный маркер ампициллин и уникальные сайты рестрикций . 3. Бактериофаг (геном представлен двунитевой ДНК) и М13 (одноцепочеченая ДНК). Левое и правое плечи фага имеют все гены, необходимые для литического цикла (репликации, размножения).Между двумя плечами помещается заменяемый фрагмент ДНК, который не нужен для развития фага. Векторы на основе бактериофага λ используют для клонирования фрагментов ДНК эукариот (т.е. более крупных генов) размером до 23 тпн. Фазмиды также являются гибридами между фагом и плазмидой. После встройки чужеродной ДНК могут в одних условиях развиваться как фаги, в других – как плазмиды. Митохондриальная ДНК также используются в качестве векторов для переноса генов в клетку. В составе митохондриальной ДНК имеются структурные гены, кодирующие полипептиды, гены рибосомных и транспортных РНК. Однако большая часть белков митохондрий, как и хлоропластов, кодируется ядерными генами. Митохондриальный геном животных организмов намного меньше, 15 – 19 т. н. п., и более консервативен по структуре. Гены митохондрий кодируют 2 группы признаков – работу дыхательных систем и устойчивость к антибиотикам и другим ядам. Искусственные хромосомы дрожжей. Векторы этого типа имеют следующие характеристики: теломеры на каждом конце,центромерные последовательности(CEN), селекционные маркеры на каждом плече, автономно реплецирующая последовательность ARS,позволяющие реплецироваться в дрожжевой клетке, рестикциооные сайты. 4. Вирусные векторы – аденовирусы (геном представлен 2-х цепочеченой ДНК) и ретровирусы (геном представлен РНК). 5. Челночные векторы – могут размножаться в разных клетках, например, бактериях и дрожжах, благодаря вставке двух сайтов Ori – для клеток прокариот и эукариот. 6. Транскрипционные векторы – содержат промоторы для получения РНК-зондов. 7. Yac (yeast artificial chromosomes) – искусственные хромосомы дрожжей. 57. Химический метод слияния протопластов. Протопласт — клетка, лишенная клеточной стенки с помощью ферментативного разрушения или механическим способом. При слиянии протопластов сначала происходит их слипание—агглютинация, а затем собственно слияние мембран. Протопласты имеют отрицательный поверхностный заряд, поэтому взаимно отталкиваются. Для процесса слияния это отталкивание должно быть преодолено или снятием, или перераспределением поверхностного заряда. Для индуцированного слияния протопластов используют химический и электрический методы. Химический метод заключается в добавлении к суспензии протопластов веществ, стимулирующих слияние. Благодаря широкому поиску эффективного фюзогена (индуктора слияния) был найден полиэтиленгликоль (ПЭГ) — хорошо растворимый в воде полимер. Предварительная обработка суспензии смешанных протопластов концентрированным раствором ПЭГ (20 - 30%) вызывает их слипание. Через 10 - 15 мин ПЭГ удаляют отмыванием раствором с щелочным рH 9 - 11 и высоким содержанием Са2+ (100 - 300 мМ), и в этом растворе мембраны слепившихся протопластов сливаются. Методика “ПЭГ - высокое рН — высокое содержание Са2+" используется в большинстве лабораторий мира. Применяя эту обработку, удается вовлечь в слияние более 10% и даже до 50% протопластов. Оптимальные результаты зависят от конкретного материала. Существуют различные точки зрения, объясняющие механизм слияния протопластов под влиянием ПЭГ. Метод имеет свои недостатки. В результате такой обработки часть протопластов повреждается и погибает. Зачастую сливаются не два, а больше протопластов, которые оказываются нежизнеспособными. Протопласты, не слившиеся после обработки, часто остаются слипшимися. 58. Физический (электрический) метод слияния протопластов. Протопласт — клетка, лишенная клеточной стенки с помощью ферментативного разрушения или механическим способом. При слиянии протопластов сначала происходит их слипание—агглютинация, а затем собственно слияние мембран. Протопласты имеют отрицательный поверхностный заряд, поэтому взаимно отталкиваются. Для процесса слияния это отталкивание должно быть преодолено или снятием, или перераспределением поверхностного заряда. Для индуцированного слияния протопластов используют химический и электрический методы. В начале 80-х годов был разработан метод электрослияния (частота слияния 20% и более). При этом для агглютинации и слияния протопластов используют электрическое поле, суспендируя их между двумя электродами. Слияние под действием электрического поля происходит с высокой эффективностью без применения каких-либо химических стимуляторов, при комнатной температуре и физиологических значениях рН. Метод электрослияния требует дорогостоящего оборудования, и поэтому многие исследователи для слияния протопластов применяют различные модификации химического метода. На способность протопластов к слиянию действует много факторов. Слияние - это случайный процесс. Частота слияния зависит не от видовой специфичности, а от особенностей ультраструктуры клеток. Так, например, меристематические и каллусные протопласты сливаются легко, а вакуолизированные и с развитыми хлоропластами — труднее. Но все-таки видовую специфику не учитывать нельзя. 59. Получение и культивирование протопластов растений. Протопласт - клетка, лишенная целлюлозной оболочки, окруженная цитоплазматической мембраной, сохраняющая все свойства, присущие растительной клетке. Впервые протопласты в 1892 г. выделил Дж. Клеркер, который использовал механический способ. При этом способе у плазмолированных клеток разрезают клеточную стенку, протопласты выходят в среду. В настоящее время метод претерпел модификации, улучшен, но имеет ряд ограничений: - невысокая производительность, - можно использовать ткани только с экстенсивным плазмолизом, - трудоемкость и длительность. Другой метод выделения протопластов - энзиматический, с использованием ферментов. В 1952 году Салтон с помощью фермента лизоцима впервые разрушил клеточную стенку бактерий. В 1960 году Коккинг обработал кончики корней томата гидролитическим ферментом из культуральной жидкости плесневых грибов Myrothecium verrucaria и впервые получил изолированные протопласты высших растений энзиматическим способом. Преимущества энзиматического метода по сравнению с механическим: - одновременно выделяется большое количество протопластов (, - клетки не подвергаются сильному осмотическому стрессу, - клетки не повреждаются, - метод сравнительно быстрый. Для удаления клеточной стенки используют ферменты трех типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Комбинация ферментов и их соотношение специфично для каждого типа клеток. Выделение протопластов проводят в три этапа: - обработка ферментами, - выделение протопластов из клеточных стенок, - отделение интактных протопластов от клеточных осколков. Условия культивирования: рН среды 5,4 - 5,8, температура 22 - 28оС, невысокая освещенность (не более 2000 лк). Способы культивирования протопластов Существуют два способа культивирования протопластов: метод жидких капель и метод платирования. В первом случае суспензию протопластов в виде капель помещают на пластиковые чашки Петри. Вариацией этого способа является культивирование единичных изолированных протопластов в микрокаплях объемом 1 мкл, предложенное Ю. Глебой в 1978 г. Во втором - суспензию протопластов наливают в пластиковые чашки Петри, добавляют равный объем той же среды с 1% агаром при температуре не выше 45оС. После остывания чашки Петри переворачивают и культивируют при 28оС. В данном случае протопласты фиксированы в одном положении и физически отделены друг от друга. Это дает возможность наблюдать за развитием интактного протопласта: формированием клеточной стенки, делением, ростом и развитием растения. Вариантом этой техники является использование кормящих протопластов или клеток, подвергнутых воздействию рентгеновского или γ-излучения, что блокирует их способность к делению. Такие протопласты или клетки смешивают с жизнеспособными протопластами и они поддерживают и стимулируют их рост. Сразу после удаления раствора фермента начинается образование клеточной стенки. Труднее добиться деления клеток и регенерации растений. Регенерация растений осуществляется либо через эмбриогенез, либо через развитие каллуса с дальнейшей индукцией морфогенеза. Добиваются этого добавлением в среду ауксинов или сочетания ауксинов с цитокининами. На пролиферацию клеток, возникших из протопластов, влияет 4 фактора: - видовая специфичность и физиологическое состояние исходной ткани растения, - способ и условия выделения протопластов, - плотность высева протопластов, - состав питательной среды. 60. Применение культуры клеток в производстве биологически активных веществ (БАВ). Для производства биологически активных веществ (БАВ) используют каллусную ткань. Примеры культур-продуцентов, которые накапливают различные ценные метаболиты: алкалоиды барвинка розового -активно применяются в качестве противоопухолевых антибиотиков. Имеются культуры-продуценты этого алкалоида, превосходящие по синтетической активности исходные растения. Таксол и другие таксаны (противораковые антибиотики, использующиеся при лечении онкологических заболеваний), получают в суспензионной культуре T.canadensis индольные алкалоиды, применяющиеся в медицине в качестве гипотензивных, антиаритмических, успокаивающих центральную нервную систему веществ. Эти метаболиты успешно получают из культуры тканей раувольфии алкалоиды барбариса (в частности берберин), способные понижать артериальное давление, повышать тонус мускулатуры матки. Их получают в культуре клеток Berberis parvifolia и других видов алкалоиды мака прицветникового – исп-ся в медицине в качестве антимикробного и антихолинэстеразного средства. В культуре тканей этот алкалоид синтезируется в количествах, превосходящих содержание в интактных растениях алкалоиды мака снотворного -: морфин, наркотин, папаверин, кардиотропные гликозиды прим-ся для комплексной терапии при нарушениях моторики сердца. В связи с широким спектром биологического действия гликозидов были получены штаммы каллусных тканей из различных эксплантов (листья, цветки, тычинки и другие) этих видов растений. тритерпеновые сапонины (гликозиды) женьшеня. Кроме того, в культуре тканей и клеток растений считается возможным получение многих вторичных метаболитов. Существуют сообщения о синтезе капсицина в культуре клеток Выделены противораковый алкалоид подофиллотоксин в культуре тканей подофила, Культура тканей лекарственных растений в настоящее время является не только подходящей моделью для изучения процессов вторичного метаболизма высших растений, но и перспективным источником веществ с высокой биологической активностью. При проведении исследований с конкретной культурой нужны новые экспериментальные данные по получению каллусных культур – продуцентов вторичных метаболитов. Необходимо исследовать их морфогентический потенциал, условия культивирования, установить зависимость между процессами накопления вторичных метаболитов и морфогенезом в каллусных культурах.