Западно-Казахстанский государственный университет им. М. Утемисова УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДИСЦИПЛИНЫ

Западно-Казахстанский государственный университет им. М. Утемисова
Естественно-географический факультет
Кафедра биологии и экологии
УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС
ДИСЦИПЛИНЫ
«Молекулярная биология»
по кредитной технологии обучения
для студентов специальности
5В011300 - Биология
Курс – IV
Семестр – VIII
Количество кредитов – 2
Лекции – 15часов
Лабораторные занятия - 15 часов
СРСП – 30 часов
СРС – 30 часов
Экзамен – в VIII-м семестре
Всего – 90 часов
Уральск- 2013
Учебно-методический комплекс дисциплины (УМКД) составлен на основании рабочей
учебной программы по дисциплине «Молекулярная биология»
Составители: к.б.н., ст. препод-ль Кайсагалиева Г.С., магистр естественных наук, ст.
преподаватель Мамышева М.В., препод-ль Чукалина О.Н.
Рассмотрено на заседании кафедры биологии и экологии
Протокол № 1 от 6 сентября 2013 г.
Рассмотрено на заседании учебно-методического совета естественно-географического
факультете
Протокол № 1 от 24 сентября 2013 г.
1. Рабочая учебная программа дисциплины «Молекулярная биология» (кафедра
«Биологии и экологии», каб.34, корпус № 5)
2. Программа обучения по дисциплине - SILLABUS
Данные о преподавателе
Ф.И.О: к.б.н., ст. препод-ль Кайсагалиева Г.С. кафедры биологии и экологии,
магистр естес. наук, ст. препод-ль кафедры биологии и экологии Мамышева М.В., препод-ль
Чукалина О.Н.
Офис: Кафедра биологии и экологии, каб. 34
Полный адрес: Западно-Казахстанский государственный университет, факультет
естественно - географический, пр. Достык-Дружбы 121
Рабочий телефон: 50-35-49.
Данные о дисциплине
Семестр состоит из 15 учебных недель и 2 недель сессии.
В неделю предполагается 2 кредит-часа, каждый кредит-час состоит из одного
контактного часа (лекция, практические занятия) и двух часов самостоятельной работы
студентов под руководством преподавателя (СРСП, СРС).
Занятия
Контактный час 1 (лекция 1)
Контактный
час
2
(практическая работа 1)
Время
проведения
50 мин.
50 мин.
Занятия СРО
Время проведения
СРСП+ СРС
СРСП+ СРС
50 + 50 мин.
50 + 50 мин.
Количество кредитов - 2
Место проведения: корпус № 5, по расписанию (аудитории 29, 30, 33)
Выписка из учебного плана:
Курс
Семестр Кредиты
4
8
2
Лекции
Лабораторные
занятия
СРСП
СРС
Всего
Форма
контроля
15
15
30
30
90
экзамен
Введение
Краткое описание курса:
Учебная дисциплина «Молекулярная биология» элективная биологическая
дисциплина, в которой излагаются основополагающие разделы: особенности строения
нуклеиновых кислот, как носителей генетической информации об организме, геномы
прокариот и эукариот, процессы репликации, транскрипции и трансляции, а также синтеза
белка.
Цель курса:
Основная цель курса состоит в создании четкой системы знаний об основных особенностях
молекулярного уровня организации прокариотной и эукариотной клеток, физиологии и
биохимии прокариот и эукариот.
Задачи курса
Обеспечить биологическую грамотность будущих специалистов в процессе освоения курса,
приобретения ими прочных знаний, касающихся молекулярного уровня организации живого
и навыков исследований на молекулярном уровне структурных элементов растительного и
животного организма и выяснения строения и функционирования важнейших органических
веществ клетки. Для достижения поставленной цели выделяются задачи курса:
1. Введение основных терминов и понятий, касающихся структуры и функционирования
наследственного аппарата клеток, экспрессии генов и белков.
2. Ознакомление слушателей со структурой биологических макромолекул: нуклеиновых
кислот, белков и липидов.
3. Ознакомление с основными принципами и участниками матричных процессов:
репликации, транскрипции и трансляции.
4. Ознакомления с основными механизмами репарации ДНК.
5. Изложение современных данных о природе генетического материала, структуре генома и
генов, механизме функционирования генов.
6. Ознакомление с современными молекулярно-биологическими методами и подходами
7. Освещение прикладных аспектов применения молекулярно-биологических методов.
8. Ознакомление с молекулярными механизмами канцерогенеза.
Методология обучения
Обучение проводится в виде лекций и лабораторных занятий, на которых студент
получает содержание основного учебного материала. Контроль знаний будет
осуществляться в виде коллоквиумов, индивидуальных семестровых заданий, письменных и
устных контрольных работ, проверки домашних задании. Для устранения пробелов знаний
будут проводиться еженедельные консультации.
Пререквизиты
Для изучения курса «Молекулярная биология» студент должен знать: биохимию, генетику,
цитологию, основы микробиологии, уметь работать с учебной литературой, иметь навыки
работы с микроскопом и лабораторным оборудованием. В результате освоения
дисциплины обучающийся должен:

иметь представление о возможностях, которые дает молекулярная биология, методы
молекулярно-генетического анализа
для выработки правильного научного
общебиологического мировоззрения и для корректной и правильной постановки
экспериментов.

знать все разделы молекулярной биологии , предусмотренные программой курса, а это
означает, что студент должен иметь представление о структуре и функциях нерегулярных
биополимеров, механизмах основных молекулярно-генетических процессов, об
организации эукариотического генома, о мобильных генетических элементах.

знать современные представления о строении и функционировании хромосом: различные
степени укладки ДНК-белковой нити, нуклеосомы и их модификации, гистоновый код.

знать свойства генетического кода и иметь представление о возникновении жизни на
Земле

иметь теоретическое представление о современных методах молекулярной биологии: о
методах клонирования и молекулярно-генетического анализа генов, о методах получения
трансгенных организмов.
Постреквизиты
По окончанию курса студент должен приобрести знания, касающиеся молекулярного
уровня организации живого и прочные навыки исследований растительного и животного
организма на молекулярном уровне.
Знания, умения и навыки, приобретенные при изучении данной дисциплины служат,
постреквизитами для следующей ступени образования – магистратуры.
Общие (универсальные) компетенции
ОК 1. Демонстрировать способность находить необходимую литературу по молекулярной
биологии, использовать базы данных и другие источники информации.
ОК 2. Уметь осуществлять поиск, отбор, систематизацию, анализ, обработку информации,
оценку ее полезности и целенаправленное применение для решения поставленных учебных
задач по молекулярной биологии.
ОК 3. Уметь представлять информацию в различных формах (рисунки, графики, таблицы,
диаграммы и пр.) и на различных носителях (бумага, электронный вариант), а также
презентовать информацию.
ОК5. Эффективно работать как индивидуально, так и в качестве члена команды.
ОК7. Понимать: роль молекулярной биологии в развитии цивилизации, соотношении науки и
техники, владеть универсальными общенаучными методами познания (анализ, синтез,
индукция, дедукция, аналогия, гипатеза, моделирование и т.д.);
ОК9. Осознавать необходимость и иметь способность самостоятельно учиться.
ОК14. Демонстрировать бережное отношение к окружающей среде.
ОК18. Уметь выражать и обосновывать свою позицию по выбору методов решения
поставленных задач относительно дисциплины молекулярная биология, корректно
отстаивать свою точку зрения.
Профессиональные компетенции
ПК1. Подбирать и критически использовать научную информацию, касающуюся
молекулярной биологии.
ПК3. Демонстрировать способность применять полученные знания для постановки,
формулирования и решения прикладных научных задач по биологии.
ПК4. Должен иметь представление о современном состоянии молекулярной биологии, ее
взаимосвязи с другими отраслями знаний, перспективах ее развития и методических основах
преподавания биологии: понимать сущность и социальную значимость своей будущей
профессии;
ПК5. Уметь формулировать и практически решать задачи в области биологии.
ПК6. Применять инновационные методы и технологии в области биологических дисциплин;
анализировать и оценивать результаты внедрения инноваций в учебно-воспитательный
процесс;
ПК7. Демонстрировать способность выбирать и использовать подходящее оборудование,
инструменты и методы.
ПК9. Демонстрировать умение проводить литературный обзор нерешенных проблем,
самостоятельно формулировать научную задачу фундаментального или прикладного
характера, находить методы решения поставленных задач, осуществлять необходимые
натурные или вычислительные эксперименты, анализировать и представлять в необходимой
форме полученные результаты и делать выводы.
ПК11. Демонстрировать умение использовать на практике знание и понимание известных
методик и технологий обучения биологии.
ПК13. Демонстрировать умение управлять учебными процессами и проводить психологопедагогические исследования, анализировать результаты проведенных и посещенных
уроков, проводить несложный методический эксперимент.
ПК 17. Должен иметь представление о современном состоянии науки молекулярная
биология.
Неделя 1
Кредит час 1
Лекция № 1
Тема: Введение. Методы перспективы развития молекулярной биологии.
Содержание лекции: Предмет молекулярной биологии сведения о функциях
распространения и локализации нуклеиновых кислот. Методы перспективы развития
молекулярной биологии.
Литература:
1. Молекулярная биология. Учебное пособие для студентов медицинских вузов Автор:
Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Изд-во: Медицинское информационное агентство,
2007. С. 536
2. Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Академия, 2011.
3. Бокуть С.В., Герасимович Н.В., Милютин А.А. Название: Молекулярная биология,
изд-во:Вышэйшая школа, Год: 2005
4. Молекулярная биология: Структура рибосом и биосинтез белка / Под ред.
А.С.Спирина. М.: Высшая школа, 1986.
5. Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рефф М., Робертс К., Уотсон Дж. Молекулярная
биология клетки в 5-и томах. М.: Мир, 1994.
6. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. В 2-х томах. М.: Мир, 1998
7. http://mirknig.com/knigi/estesstv_nauki/1181407460-molekulyarnaya-biologiya.html
8. http://molbiol.ru/
9. Уотсон Дж., Туз Дж., Куру Д. Рекомбинантные ДНК. М.: Мир, 1986.
10. Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология в 3-х томах. М.: Мир, 1982.
Тема СРСП: Структурная организация эукариот.
Кредит час 2
Лабораторная работа № 1
Тема: Компоненты нуклеиновых кислот.
Содержание лабораторного занятия: Пространственная структура ДНК. Модель УотсонаКрика.
Тема СРСП: История развития молекулярной биологии.
Тема СРС: Доказательство генетической роли нуклеиновой кислоты.
Литература:
1. Молекулярная биология. Учебное пособие для студентов медицинских вузов Автор:
Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Изд-во: Медицинское информационное агентство,
2007. С. 536
2. Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Академия, 2011.
3. Бокуть С.В., Герасимович Н.В., Милютин А.А. Название: Молекулярная биология,
изд-во:Вышэйшая школа, Год: 2005
4. http://mirknig.com/knigi/estesstv_nauki/1181407460-molekulyarnaya-biologiya.html
Тема СРСП: Структурная организация эукариот.
Тема СРС: Отличия в строении эукариот и прокариот.
Неделя 2
Кредит час 3
Лекция № 2
Тема: Молекулярные механизмы репликации.
Содержание лекции: Роль нуклеиновых кислот как носителей генной информации
первичная структура нуклеиновых кислот макромолекулярная структура ДНК.
Литература:
1. Молекулярная биология. Учебное пособие для студентов медицинских вузов Автор:
Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Изд-во: Медицинское информационное агентство,
2007. С. 536
2. Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Академия, 2011.
3. Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рефф М., Робертс К., Уотсон Дж. Молекулярная
биология клетки в 5-и томах. М.: Мир, 1994.
4. Уотсон Дж., Туз Дж., Куру Д. Рекомбинантные ДНК. М.: Мир, 1986.
5. Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология в 3-х томах. М.: Мир, 1982.
Тема СРСП: Экспериментальное доказательство полуконсервативного способа репликации
ДНК.
Кредит час 4
Лабораторная работа № 2
Тема: Репликация ДНК.
Содержание лабораторного занятия: Типы репликации ДНК, ключевые ферменты
репликации ДНК (ДНК-полмеразы, ДНК-лигазы)
Литература:
1. Молекулярная биология. Учебное пособие для студентов медицинских вузов Автор:
Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Изд-во: Медицинское информационное агентство,
2007. С. 536
2. Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Академия, 2011.
3. Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рефф М., Робертс К., Уотсон Дж. Молекулярная
биология клетки в 5-и томах. М.: Мир, 1994.
4. Уотсон Дж., Туз Дж., Куру Д. Рекомбинантные ДНК. М.: Мир, 1986.
5. Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология в 3-х томах. М.: Мир, 1982.
Тема СРСП: Экспериментальное доказательство полуконсервативного способа репликации
ДНК.
Тема СРС: Инициация синтеза ведущей цепи
Неделя 3
Кредит час 5
Лекция № 3
Тема: Структура и функции РНК.
Содержание лекции: Виды РНК, макромолекулярная структура РНК.
Литература:
1. Уотсон Дж. Молекулярная биология гена. М.: Мир, 1978.
2. Молекулярная биология. Учебное пособие для студентов медицинских вузов Автор:
Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Изд-во: Медицинское информационное агентство,
2007. С. 536
3. Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Академия, 2011.
Тема СРСП: Строение информационной РНК эукариот.
Кредит час 6
Лабораторная работа № 3
Тема: Транскрипция.
Содержание лабораторного занятия: Строение информационной РНК, функциональные
участки в РНК-полимеразе, их значение.
Литература:
1. Молекулярная биология. Учебное пособие для студентов медицинских вузов Автор:
Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Изд-во: Медицинское информационное агентство,
2007. С. 536
2. Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Академия, 2011.
3. Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рефф М., Робертс К., Уотсон Дж. Молекулярная
биология клетки в 5-и томах. М.: Мир, 1994.
Тема СРСП: Строение информационных РНК эукариот.
Тема СРС: Структура промоторов РНК-полимеразы II.
Неделя 4
Кредит час 7
Лекция № 4
Тема: Созревание РНК: процессинг и сплайсинг.
Содержание лекции: Эндонуклеотические и экзонуклеотические ферменты. Созревание
транспортных РНК.
Литература:
1. Молекулярная биология. Учебное пособие для студентов медицинских вузов Автор:
Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Изд-во: Медицинское информационное агентство,
2007. С. 536
2. Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Академия, 2011.
3. Уотсон Дж., Туз Дж., Куру Д. Рекомбинантные ДНК. М.: Мир, 1986.
4. Льюин Б. Гены. М.: Мир, 1987.
5. Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология в 3-х томах. М.: Мир, 1982.
Тема СРСП: Сплайсинг ядерных РНК эукариот.
Кредит час 8
Лабораторная работа № 4
Тема: РНК.
Содержание лабораторного занятия: Созревание транспортных РНК, механизмы
сплайсинга РНК.
Литература:
1. Молекулярная биология. Учебное пособие для студентов медицинских вузов Автор:
Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Изд-во: Медицинское информационное агентство,
2007. С. 536
2. Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Академия, 2011.
3. Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рефф М., Робертс К., Уотсон Дж. Молекулярная
биология клетки в 5-и томах. М.: Мир, 1994.
4. Уотсон Дж., Туз Дж., Куру Д. Рекомбинантные ДНК. М.: Мир, 1986.
5. Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология в 3-х томах. М.: Мир, 1982.
6. Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рефф М., Робертс К., Уотсон Дж. Молекулярная
биология клетки в 5-и томах. М.: Мир, 1994.
7. Уотсон Дж., Туз Дж., Куру Д. Рекомбинантные ДНК. М.: Мир, 1986.
Тема СРСП: Сплайсинг ядерных РНК эукариот.
Тема СРС: Рибонуклеаза III E. coli
Неделя 5
Кредит час 9
Лекция № 5
Тема: Биосинтез белка
Содержание лекции: Генетический код, активация аминокислот, строение рибосом
прокариотов и эукариотов
Литература:
1. Молекулярная биология. Учебное пособие для студентов медицинских вузов Автор:
Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Изд-во: Медицинское информационное агентство,
2007. С. 536
2. Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Академия, 2011.
3. Молекулярная биология: Структура рибосом и биосинтез белка / Под ред.
А.С.Спирина. М.: Высшая школа, 1986.
Тема СРСП: Экспериментальная расшифровка генетического кода.
Кредит час 10
Лабораторная работа № 5
Тема: Получение раствора растительного белка и изучение его свойств.
Содержание лабораторного занятия: Проведение биуретовой, ксантопротеиновой,
миллоновой реакций и изучение свойств белка.
Литература:
1.Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. М.: Высшая школа,
1996.
Тема СРСП: Экспериментальная расшифровка генетического кода.
Тема СРС: α-образная пространственная структура тРНК.
Неделя 6
Кредит час 11
Лекция № 6
Тема: Процесс биосинтеза белка на рибосомах.
Содержание лекции: Этапы биосинтеза белка на рибосомах: инициация, элонгация,
терминация.
Литература:
1.Молекулярная биология: Структура рибосом и биосинтез белка / Под ред. А.С.Спирина.
М.: Высшая школа, 1986.
Тема СРСП: Регуляция трансляции.
Кредит час 12
Лабораторная работа № 6
Тема: Выделение и изучение свойств дезорибонуклеопротеидов.
Содержание лабораторного занятия: Качественная реакция на ДНК, выделение
нуклеотидов из дрожжей, гидролиз нуклеопротеидов.
Литература:
1.Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Высшая школа, 1990.
Тема СРСП: Регуляция трансляции.
Тема СРС: Перепрограммирование трансляции.
Неделя 7
Кредит час 13
Лекция № 7
Тема: Тонкое строение гена.
Содержание лекции: Структура генома эукариот, последовательности нуклеотидов
эукариотического генома.
Литература:
1.Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Высшая школа, 1990.
2.Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология в 3-х томах. М.: Мир, 1982.
Тема СРСП: Геномы органелл эукариот.
Кредит час 14
Лабораторная работа № 7
Тема: Структура эукариотических геномов.
Содержание лабораторного занятия: Гены, кодирующие рибосомные гены, гены тРНК,
гистоновые гены.
Литература:
1.Молекулярная биология: Структура рибосом и биосинтез белка / Под ред. А.С.Спирина.
М.: Высшая школа, 1986.
2.Льюин Б. Гены. М.: Мир, 1987.
3.Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология в 3-х томах. М.: Мир, 1982.
Тема СРСП: Геномы органелл эукариот.
Тема СРС: Тандемные повторы.
Неделя 8
Кредит час 15
Лекция № 8
Тема: Структура генома вирусов и фагов.
Содержание лекции: Типы генетического материала и механизм его репликации у
различных вирусов типы взаимодействия вируса с клеткой-хозяином.
Литература:
1.Уотсон Дж. Молекулярная биология гена. М.: Мир, 1978.
2.Льюин Б. Гены. М.: Мир, 1987.
3.Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология в 3-х томах. М.: Мир, 1982.
Тема СРСП: Происхождение вирусов и их роль в эволюции.
Кредит час 16
Лабораторная работа № 8
Тема: Геном прокариот.
Содержание лабораторного занятия: Структура бактериальной хромосомы, бактериальные
плазмиды.
Литература:
1.Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Высшая школа, 1990.
2.Льюин Б. Гены. М.: Мир, 1987.
3.Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология в 3-х томах. М.: Мир, 1982.
Тема СРСП: Происхождение вирусов и их роль в эволюции.
Тема СРС: Характеристика некоторых вирусов.
Неделя 9
Кредит час 17
Лекция № 9
Тема: Молекулярные основы мутаций.
Содержание лекции: Концентрация мутаций, частота мутирования и причины мутаций.
Литература:
1.Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология в 3-х томах. М.: Мир, 1982.
Тема СРСП: Происхождение вирусов и их роль в эволюции.
Кредит час 18
Лабораторная работа № 9
Тема: Типы и причины мутаций.
Содержание лабораторного занятия: Мутагенное действие физических факторов и ошибки
репликации, не исправленные ДНК-полимеразой.
Литература:
2.Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология в 3-х томах. М.: Мир, 1982.
Тема СРСП: Происхождение вирионов
Тема СРС: Бактериофаги, их специфичность.
Неделя 10
Кредит час 19
Лекция № 10
Тема: Системы защиты ДНК у прокариот.
Содержание лекции: Ферменты, модифицирующие структуру ДНК (репарация). Системы
модификации и рестрикции.
Литература:
1.Молекулярная биология: Структура рибосом и биосинтез белка / Под ред. А.С.Спирина.
М.: Высшая школа, 1986.
2.Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. М.: Высшая школа,
1996.
3.Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рефф М., Робертс К., Уотсон Дж. Молекулярная
биология клетки в 5-и томах. М.: Мир, 1994.
4.Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология в 3-х томах. М.: Мир, 1982.
Тема СРСП: Программируемая клеточная смерть.
Кредит час 20
Лабораторная работа № 10
Тема: Репарация повреждений ДНК.
Содержание лабораторного занятия: Классификация повреждающих событий. Системы
эксцизионной и других видов репараций.
Литература:
1.Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Высшая школа, 1990.
2.Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология в 3-х томах. М.: Мир, 1982.
Тема СРСП: Программируемая клеточная смерть.
Тема СРС: Механизмы обращения повреждений.
Неделя 11
Кредит час 21
Лекция № 11
Тема: Контроль генной экспрессии у прокариот.
Содержание лекции: Конститутивные и индуцируемые ферменты, концепция оперона,
триптофановый оперон.
Литература:
1.Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рефф М., Робертс К., Уотсон Дж. Молекулярная
биология клетки в 5-и томах. М.: Мир, 1994.
2.Сингер М., Берг П. Гены и геномы. В 2-х томах. М.: Мир, 1998
Тема СРСП: Триптофановый оперон (структура и функционирование).
Кредит час 22
Лабораторная работа № 11
Тема: Концепция оперона.
Содержание лабораторного занятия: Открытие регуляторного гена, контролирующая
система оперона, контакты в операторе, катаболитная репрессия.
Литература:
1.Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Высшая школа, 1990.
2.Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология в 3-х томах. М.: Мир, 1982.
Тема СРСП: Триптофановый оперон (структура и функционирование).
Тема СРС: Триптофановый оперон (аттенуация экспрессии).
Неделя 12
Кредит час 23
Лекция № 12
Тема: Генетические механизмы эволюции прокариот.
Содержание лекции: Генетический аппарат прокариот, изменение генетического материала,
коньюгация у бактерий, генетический контроль.
Литература:
Уотсон Дж. Молекулярная биология гена. М.: Мир, 1978.
Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Высшая школа, 1990.
Молекулярная биология: Структура рибосом и биосинтез белка / Под ред. А.С.Спирина. М.:
Высшая школа, 1986.
Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. М.: Высшая школа,
1996.
Тема СРСП: Регуляторные системы у прокариот (регуляция клеточного метаболизма,
активности ферментов, синтеза ферментов).
Кредит час 24
Лабораторная работа № 12
Тема: Генетика прокариот.
Содержание лабораторного занятия: Фенотипическая и генотипическая изменчивость
прокариот. Значение мутаций, перспективы генной инженерий.
Литература:
1.Сингер М., Берг П. Гены и геномы. В 2-х томах. М.: Мир, 1998
2.Уотсон Дж., Туз Дж., Куру Д. Рекомбинантные ДНК. М.: Мир, 1986.
3.Льюин Б. Гены. М.: Мир, 1987.
4.Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология в 3-х томах. М.: Мир, 1982.
Тема СРСП: Регуляторные системы у прокариот (регуляция клеточного метаболизма,
активности ферментов, синтеза ферментов).
Тема СРС: Регуляция различных метаболических путей, межклеточных взаимодействий.
Неделя 13
Кредит час 25
Лекция № 13
Тема: Цикл репродукции вирусов.
Содержание лекции: Структурная организация вирусов, цикл репродукции вирусов,
культивирование и вирусный канцерогенез.
Литература:
1.Уотсон Дж. Молекулярная биология гена. М.: Мир, 1978.
2.Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Высшая школа, 1990.
3.Молекулярная биология: Структура рибосом и биосинтез белка / Под ред. А.С.Спирина.
М.: Высшая школа, 1986.
Тема СРСП: Бактериофаги.
Кредит час 26
Лабораторная работа № 13
Тема: Вирусный канцерогенез.
Содержание лабораторного занятия: Структурная организация вирусов.
Литература:
1.Молекулярная биология: Структура рибосом и биосинтез белка / Под ред. А.С.Спирина.
М.: Высшая школа, 1986.
2.Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. М.: Высшая школа,
1996.
3.Сингер М., Берг П. Гены и геномы. В 2-х томах. М.: Мир, 1998
4.Уотсон Дж., Туз Дж., Куру Д. Рекомбинантные ДНК. М.: Мир, 1986.
5.Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология в 3-х томах. М.: Мир, 1982.
Тема СРСП: Бактериофаги.
Тема СРС: Плазмиды бактерий.
Неделя 14
Кредит час 27
Лекция № 14
Тема: Современные аспекты и задачи генной инженерии.
Содержание лекции:
Генетическая инженерия методы генетической инженерии,
регистрация ДНК.
Литература:
1.Уотсон Дж. Молекулярная биология гена. М.: Мир, 1978.
2.Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Высшая школа, 1990.
3.Молекулярная биология: Структура рибосом и биосинтез белка / Под ред. А.С.Спирина.
М.: Высшая школа, 1986.
4.Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология в 3-х томах. М.: Мир, 1982.
Тема СРСП: Химический синтез гена.
Кредит час 28
Лабораторная работа № 14
Тема: Гибридизация нуклеиновых кислот.
Содержание лабораторного занятия: Гибридизация нуклеиновых кислот коннекторным,
рестриктазно-лигазным методами.
Литература:
1.Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Высшая школа, 1990.
2.Молекулярная биология: Структура рибосом и биосинтез белка / Под ред. А.С.Спирина.
М.: Высшая школа, 1986.
3.Уотсон Дж., Туз Дж., Куру Д. Рекомбинантные ДНК. М.: Мир, 1986.
Тема СРСП: Химический синтез гена.
Тема СРС: Методы промышленной микробиологии.
Неделя 15
Кредит час 29
Лекция № 15
Тема: Достижения и перспективы генной инженерии.
Содержание лекции: Получение биологических активных соединений синтез интерферонов
генетическая трансформация.
Литература:
1.Уотсон Дж. Молекулярная биология гена. М.: Мир, 1978.
2.Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Высшая школа, 1990.
3.Молекулярная биология: Структура рибосом и биосинтез белка / Под ред. А.С.Спирина.
М.: Высшая школа, 1986.
4.Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. М.: Высшая школа,
1996.
Тема СРСП: Трансформация, клонирование и селекция.
Кредит час 30
Лабораторная работа № 15
Тема: Векторы, применяемые в генной инженерии.
Содержание лабораторного занятия: Плазмидные векторы, фаговые векторы, плазмиднофаговые векторы.
Литература:
1.Методы анализа белков и нуклеиновых кислот. Методические разработки/ Под ред.
Ю.Б.Филипповича, Г.А.Себастьяновой. Ч.1., М.: Мир, 1980.
2.Бисенбаев А.К., Таиров М.М., Берсимбаев Р.И. Большой практикум «Биохимические
методы исследования». Алматы: Қазақ университеті, 1998.
3.Yongming Li, Zhao Yugi. Practical protocols in molecular biology.
Тема СРСП: Трансформация, клонирование и селекция.
Тема СРС: Способы получения ДНК для клонирования.
2.5 Список литературы
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Основная
Молекулярная биология. Учебное пособие для студентов медицинских вузов Автор:
Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Изд-во: Медицинское информационное агентство,
2007. С. 536
Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Академия, 2011.
Бокуть С.В., Герасимович Н.В., Милютин А.А. Название: Молекулярная биология,
изд-во:Вышэйшая школа, Год: 2005
Молекулярная биология: Структура рибосом и биосинтез белка / Под ред.
А.С.Спирина. М.: Высшая школа, 1986.
Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рефф М., Робертс К., Уотсон Дж. Молекулярная
биология клетки в 5-и томах. М.: Мир, 1994.
Сингер М., Берг П. Гены и геномы. В 2-х томах. М.: Мир, 1998
Уотсон Дж., Туз Дж., Куру Д. Рекомбинантные ДНК. М.: Мир, 1986.
Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология в 3-х томах. М.: Мир, 1982.
Дополнительная
1. С. Примроуз, Р. Тваймен Геномика. Роль в медицине. Бином. Лаборатория знаний.
2008.
2. С. Н. Щелкунов Генетическая инженерия Сибирское университетское издательство
2004
3. С. В. Разин, А. А. Быстрицкий. Хроматин. Упакованный геном. Бином. Лаборатория
знаний. 2009 г.
4. Ратнер В.А. Генетика, молекулярная кибернетика: личности и проблемы. Новосибирск: Наука, 2002. 272 c. http://lib.walla.ru/djvu/dbp45.zip
5. Ратнер В.А. Хроника великого открытия: идеи и лица // Природа. 2000. № 6. С. 22-30.
http://vivovoco.astronet.ru/VV/JOURNAL/NATURE/06_00/CODE/CODE.HTM
6. Ратнер В.А. Генетический код как система // Соросовский образовательный журнал.
2000. Т. 6. № 3. С. 17-22. http://www.pereplet.ru/nauka/Soros/pdf/0003_017.pdf
7. А.С.Спирин. Биосинтез белка: инициация трансляции. СОЖ 1999 №5
8. Л.П. Овчинников. Что и как закодировано в мРНК. СОЖ 1998 №4
9. С.Г. Инге-Вечтомов. Трансляция как способ существования живых систем, или в чем
смысл «бессмысленных» кодонов. СОЖ 1996, №12
программное обеспечение и Интернет-ресурсы:
1. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика pdf-версия учебника – url:
http://www.nsu.ru/education/biology/genetics/
2. Колесникова Т.Д. Подборка литературы для самостоятельного чтения и выполнения
домашних заданий: http://engrailed.narod.ru/molbiol/
3. http://mirknig.com/knigi/estesstv_nauki/1181407460-molekulyarnaya-biologiya.html
4. http://molbiol.ru/
3. ГРАФИК ВЫПОЛНЕНИЯ И СДАЧИ ЗАДАНИЙ ПО ДИСЦИПЛИНЕ
№
п/п
1
2
Вид работ
Готовность к
лабораторным
занятиям
Задание СРС
3
Выполнение
заданий СРСП
4
Контрольная
работа
5
Микроэкзамен
Цель и содержание
задания
Рекомендуемая
литература
Основной ответ по
теме
Согласно теме
лабораторного
занятия
Согласно теме
СРС
Проверка
самостоятельной
работы
Развитие
аналитических и
познавательных
способностей и
проверка
теоретической
подготовки
Проверка
теоретической
подготовки по
изученному материалу
Комплексная проверка
знаний
Согласно теме
СРСП
Продолжительность
выполнения и дата
(неделя) представления
работы
Неделя
Баллы (max)
Форма контроля
100%
Неделя
100%
Конспект хода
работы и ответ на
контрольные вопросы
Проверка письменной
работы
Неделя
100%
Основная и
Неделя
дополнительная
литература,
указанная в
силлабусе
Основная и
7,15 недели
дополнительная
литература,
указанная в
силлабусе
100%
100%
Проверка выполнения
задания, способность
ответа на вопросы,
демонстрация схем,
презентаций, защита
реферативных
сообщений
Письменная работа
по вариантам
Тестовые задания
4. КАРТА УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЙ ОБЕСПЕЧЕННОСТИ
№
п/п
1
1
2
3
Наименование
литературы
2
СБ. Бокуть, Н.В.
Герасимович, А.А.
Милютин «Молекулярная
биология» Минск
«Высшая школа» 2005
Р.И. Берсимбаев, Н.К.
Болегенова, Л.Б.
Джансугурова, З.Г.
Айташева
«Молекулярная
биология» Сборник
вопросов, тестов и задач
Алматы 2006 г
Молекулярная биология:
Структура и биосинтез
нуклеиновых кислот/ Под
ред. А.С.Спирина. М.:
Высшая школа, 2003 г.
на
в библиотеке
кафедр
е
3
4
14
5
Степанов В.М.
Молекулярная биология.
Структура и функции
белков. М.: Высшая
школа, 1996 г.
10
6
Шоканов Н.К.
Микробиология.
Учеб. Алматы: Санат,
1997
Учебники
по
молекулярной биологии
70
6
100
100
15
Молекулярная
биология: Структура
рибосом и биосинтез
белка / Под ред.
А.С.Спирина. М.:
Высшая школа. 1986 г.
7
5
1
23
4
Примеч
Наличие
обеспеченнос электронна ания
ти студентов
я версия
(%)
5
1
1
1
100
1
37,5
100
100
http://mirkni
g.com/knigi/
estesstv_nau
ki/11814074
60molekulyarn
ayabiologiya.ht
ml
7
5. Лекционный комплекс
Неделя 1
Кредит час 1
Лекция № 1
Тема: Введение.
Цель: Ознакомить с основными целями и задачами предмета молекулярной биологии, с
историей развития науки.
Содержание лекции: Молекулярная биология возникла во второй половине XX в. Название
этой науки чаще всего связывают с именем У. Эстбюри, который в 1939 г. назвал себя
«молекулярным биологом». Через два года он же получил первую рентгенограмму ДНК и
тем самым положил начало изучению тонкой структуры «самой главной молекулы»,
впервые выявленной Ф. Мишером еще в 1969 г. Первое официальное упоминание о
молекулярной биологии, вероятно, принадлежит У. Уиверу, руководившему отделом
естественных наук Рокфеллеровского фонда, который в 1938 г. написал: «В тех пограничных
областях, где химия и физика пересекаются с биологией, постепенно возникает новый
раздел науки - молекулярная биология, начинающая приоткрывать завесы над многими
тайнами, окутывающими основные элементы живой клетки». Таким образом, было
постулировано возникновение нового направления современной биологии, которое
интегрировало усилия биологов, химиков и физиков в области изучения объектов живой
природы.
Разработка тонких физических и химических методов анализа структуры и функций
молекул, свойственных всем живым системам и прежде всего клетке как элементарной и
универсальной составляющей всех организмов, имела определяющее значение для
рождения молекулярной биологии. Мощным стимулом для развития стали успехи и еще в
большей мере нерешенные проблемы биохимии, цитологии и генетики. Эти
сформировавшиеся к середине XX в. биологические науки создали почву для молекулярной
биологии, которая была призвана занять изучением жизни на молекулярном уровне.
Центром молекулярно-биологических исследований стали работы в области изучения
материальных основ наследственности, природы генов и механизмов передачи
наследственных признаков из поколения в поколение.
Именно под влиянием генетиков новой формации (Т. Моргана, Н.К. Кольцова, Н.В.
Тимофеева-Ресовского и др.) физики-теоретики и экспериментаторы, эмигрировавшие в
конце 30-х годов из Европы в США, организовали там так называемую «фаговую группу» во
главе с М. Дельбрюком, которая начала исследования в области молекулярного строения и
мутагенеза вирусов и бактериофагов. Позднее эти работы были существенно развиты в нашей
стране Б.Ф. Поглазовым, Н.А. Киселевым и другими ученными. Еще раньше В.А.
Энгельгардт совместно с М.Н. Любимовой обосновали молекулярные механизмы мышечного
сокращения, а А.Н. Белозерский впервые выделил ДНК из растений, что также относится к
фундаментальным вехам становления молекулярной биологии. Впоследствии именами этих
замечательных были названы крупнейшие научно-исследовательские центры: Институт
молекулярной биологии АН СССР им. В.А. Энгельгардта и Институт физико-химической
биологии им. А.Н. Белозерского.
К началу 50-х годов XX в. в недрах биохимии были получены фундаментальные
данные об элементарном строении белков и нуклеиновых кислот, включая сведения о
способах организации полипептидных цепей белков, и, что особенно важно, о структуре
нуклеотидов и закономерностях их количественного содержания в молекулах ДНК и РНК (Э.
Чаргафф). Именно указанные работы, а также биофизические исследования структуры ДНК,
выполненные в Англии методом рентгеноструктурного анализа Розалиндой Франклин и
Морисом Уилкинсом, вплотную подвели воспитанника «фаговой группы» Джеймса Уотсона
и английского физика Френсиса Крика к раскрытию молекулярной природы генов и
механизма их воспроизведения (репликации) в составе ДНК.
Создание модели двойной спирали ДНК и открытия принципа комплементарности
стали важнейшим событием современной биологии, вскрывшим фундаментальные
принципы функционирования живых систем и определившим дальнейшие направления
исследований современной биологии. Современное естествознание обязано именно
молекулярной биологии тем, что в период с середины 50-х до середины 70-х годов XX в. с
невероятной быстротой были раскрыты природа и основные пути передачи реализации
генетической информации.
Основополагающие открытия молекулярной биологии
1869 - Ф. Мишер (F. Miesher) впервые выделил ДНК из лейкоцитов и молок лосося.
1935 - А.Н. Белозерский выделил ДНК из растений.
1939- В.А. Энгельгардт открыл АТФ-азную активность миозина.
1940- У. Эстбюри (W. Astbury) получил первую рентгенограмму ДНК.
1944 - О.Т. Эвери (О.Т. Avery) установил, что ДНК (а не белок, как полагали ранее)
является носителем генетической информации.
1951 -Л. Полинг и Р. Кюри (L. Pauling, R. Corey) обосновали существование основных
типов укладки аминокислотных остатков в полипептидных цепях белков (а- спираль и
складчатый (3- слой).
1953 - Дж. Уотсон и Ф. Кюри (J. Watson, F. Crick) создали модель двойной спирали ДНК
на основе рентгенограмм, полученных Р. Франклин и М. Уилкинсом (R. Franklin, М.
Wilkins).
1953 - Ф. Сангер (F. Sanger) расшифровал первичную структуру инсулина быка.
1956- А. Корнберг (A. Kornberg) открыл ДНК-полимеразу.
1957- А.Н. Белозерский и А.С. Спирин предсказали существование мРНК.
1960 - Дж. Кедрью (J. Kendrew) впервые описал трехмерную структуру миоглобина
кашалота, а М. Перутц (М. Perutz) - структуру гемоглобина.
1960 - одновременно в нескольких лабораториях был открыт фермент транскрипции
РНКполимераза.
1961- Ф. Жакоб и Дж. Моно (F. Jakob, J. Monod) разработали модель оперона.
1965-1967 - Р. Холи (R. Holley) выяснил первичную структуру аланиновой т-РНК, а
А.А. Наев --валиновой т-РНК.
1966
- М. Ниренберг, С. Очоа и Х.-Г. Корана (М. Nirenberg, S. Oshoa, H.-G. Khorana)
расшифровал генетический код.
1967 - М. Геллерт (М. Gellert) открыл ДНК-лигазу - фермент, способный соединять
фрагменты
ДНК.
1970 - Г. Темин и Д. Балтимор (Н. Temin, D. Baltimor) открыли обратную транскриптазу
(РНК-зависимую ДНК-полимеразу) в онкогенных вирусах.
1972 - П. Боэр, С. Коэн и П. Берг (P. Boyer, S. Cohen, P. Berg) разработали технологию
клонирования ДНК, заложили основы генетической инженерии.
1972 - Х.-Г. Корана (H-G. Khorana) осуществил химический синтез гена аланиновой тРНК.
1975-1977 - Ф. Сангер (F. Sanger), а также А. Максам и У. Гилберт (A. Maxam, W.
Gilbert) разработали методы быстрого определения первичной структуры ДНК.
1976 - Ф. Сангер (F. Sanger) расшифровал нуклеотидную последовательность ДНК фага
φрХ 174.
1976 - У. Гилберт (W. Gilbert) открыл мозаичное строение генов эукариот.
1976 - С. Ким, А. Рич и А. Клуг (S. Kim, A. Rich, A. Klug) определили третичную
структуру т-РНК.
В результате выдающихся открытий Дж. Уотсона, Ф.Крика, Х.-Г. Кораны, А.
Корнберга и других крупнейших молекулярных биологов, удостоенных нобелевских премий,
уже в середине 60-х годов XX в. окончательно утвердился основной постулат молекулярной
генетики, формулирующий магистрал19က19й путь реализации генетической информации в
клетке:
ДНК→РНК→Белок
Затем были детально изучены механизмы воспроизведения (репликация) ДНК,
транскрипции (биосинтеза РНК) и трансляции (биосинтеза белка). Параллельно развивалась
работы по изучению внутриклеточной локализации этих процессов, что привело к
осознанию функционального значения внутриклеточных компонентов (ядра, митохондрий,
рибосом и др.) и дало основание Дж. Уотсону в 1968,г. для определения молекулярной
биологии: «Молекулярная биология изучает связь структуры биологических макромолекул и
основных клеточных компонентов с их функцией, а также основные принципы и механизмы
саморегуляции клеток, которые опосредуют согласованность и единство всех протекающих
в клетке процессов, составляющих сущность жизни».
Впоследствии центральный постулат молекулярной генетики был дополнен
представлениями о существовании процесса обратной транскрипции (о биосинтезе ДНК на
матрице РНК) и репликации РНК.
Одновременно все более детализировались представления о строении и функциях
белков, необходимых для катализа (ферменты) и регуляции (регуляторные белки,
пептидные гормоны) всех важнейших молекулярно-генетических процессов.
Открытие и разработка методов целенаправленного использования цельного ряда
ферментов (обратной транскриптазы, ДНК-рестиктаз и др.) привели к созданию технологии
получения рекомбинантных ДНК, возникновению генетической инженерии, что стало
поистине революционным событием в истории молекулярной биологии.
В конце 70-х и начале 80-х годов XX в. молекулярная биология вступает в период
расцвета. В это время выясняются механизмы сплайсинга (В. Келлер и др.), происходит
открытие РНК-ферментов (рибозимов) и аутосплайсинга (Т. Чек), активно изучают
механизмы генетической рекомбинации и подвижные генетические элементы (Д. Хогнесс,
Г.П. Георгиев), на новый уровень выходят работы в области структуры ферментов и
биологических мембран (Ю.А. Овчинников), начинаются работы по расшифровке структуры
геномов высших организмов (включая геном человека), создаются основы новых (генноинженерных) биотехнологий, обнаруживаются и синтезируются каталитически активные
антитела (абзимы), возникает белковая инженерия.
Постепенно молекулярная биология становится в центре наук, составляющих
современную физико-химическую биологию:
Биофизика
↔
Физико-химическая
биология
Молекулярная биология
↔ Биохимия
↔
Биоорганическая химия
Бурное развитие молекулярной биологии привело в начале 80-х годов XX в. к
возникновению новой науки — биоинформатики (вычислительной биологии, компьютерной
генетики), возникшей на стыке молекулярной генетики и информатики. Толчком к ее
возникновению
послужило
быстрых
методов
определения
нуклеотидных
последовательностей ДНК, разработанных в 1975-1976 гг. Ф. Сангером и А. Коулсоном. а
также А. Максамом и У. Гилбертом. В 1982 г. были организованы банки нуклеотидных
последовательностей: Gen Bank в США и EMBL в Европе, которых концентрировалась
информация о расшифрованных нуклеотидных последовательностях ДНК различных
организмов. Постепенно биоинформатика включилась в разработку ряда важных
молекулярно-биологических проблем, включая: статистический анализ нуклеотидных
последовательностей ДНК; предсказание функций по первичной структуре биополимеров
(ДНК, РНК и белков); анализ (моделирование) пространственной структуры белков и
нуклеиновых кислот; теорию молекулярной эволюции и систематики.
Прогресс в области определения нуклеотидных последовательностей (секвенирования)
ДНК различных организмов, достигнутый в конце XX в. (в 1995 г. был секвенирован первый
бактериальный геном, в 1997 г. - геном дрожжей, 1998 г. - геном нематоды, в 2000 г. - геном
дрозофилы и почти полностью геном человека), привел к возникновению геномики - науки,
изучающей наборы всех генов данного организма как единое целое. Одновременно возникла
протеомика - наука, исследующая полные наборы белков, функционирующих на различных
этапах развития того или иного организма.
В конце XX в. расширяются и становятся все более целенаправленными в научнопрактическом отношении задачи молекулярной биологии, среди которых:
 расшифровка структуры геномов;
 создание банков генов;
 геномная дактилоскопия;
 изучение молекулярных основ эволюции, дифференцировки, биоразнообразия,
развития и старения, канцерогенеза, иммунитета и др.;
 создание методов диагностики и лечения генетических болезней, вирусных
заболеваний;
 создание новых биотехнологий производства пищевых продуктов и
разнообразных биологически активных соединений (гормонов, антигормонов,
релизинг-факторов, энергоносителей и др.).
Начало нового тысячелетия ознаменовалась выдающимся событием - расшифровкой
нуклеотидной последовательности генома человека, с которой связаны надежды на решение
многих проблем человечества (коррекция наследственных заболеваний, продление жизни и
т.д.).
Таким образом, по праву считается, что XXI в. должен стать веком молекулярной
биологии и новых биотехнологий, призванных освободить человечество от тяжкого груза
болезней, пороков и лишений и заложить основы его будущего процветания.
Методы молекулярной биологии
Молекулярная биология использует широкий арсенал биологических, физических и
химических методов.
Микроскопия - имеет давнюю историю, начиная с XVII в., когда в 1611 г. И. Кеплер
предложил принцип создания светового микроскопа, а А. Левенгук впервые наблюдал с его
помощью одноклеточные бактерии (1638). Именно световая микроскопия, имеющая предел
разрешения 0,4-0,7 мкм, позволила М. Шлейдену и Т. Шванну в 1838 г. создать клеточную
теорию, согласно которой клетка, содержащая ядро, является структурной и
функциональной единицей строения всех животных и растений. Затем Р.А. Колликер
впервые в 1857 г. описал митохондрии, а В.Флемминг - поведение хромосом при митозе.
В
развитии
микроскопии
существенными
вехами
стали
изобретения
интерференционного (1930). фазово-контрастного (1932) и, наконец, электронного
микроскопов (1939).
Электронная микроскопия, позволяющая обычно различать объекты размером около 20
Аº (2 нм) и имеющая в наиболее современных моделях электронных микроскопов предел
разрешения до 0,1 нм, нашла самое широкое применение для изучения структур вирусов,
внутриклеточных органелл, белково-нуклеиновых комплексов (хроматин, рибосомы,
информосомы) и отдельных белковых молекул. Один из вариантов этого метода кариоэлектронная микроскопия - является в настоящее время ведущим при изучения тонкой
структуры рибосом.
Наиболее впечатляющие и информативные трехмерные (объемные) изображения
клеточных структур позволяют получить сканирующие электронные микроскопы.
Рентгеноструктурный анализ - основан на дифракции рентгеновских лучей
(электромагнитного излучения с длиной волны около 10 -10 м); позволяет выявить трехмерное
расположение атомов в молекулах (разрешение составляет менее 0,1 нм). Метод был
разработан в Англии Г. Брэггом и Л. Брэггом, и именно с его помощью были получены
основополагающие сведения о структуре молекул белков, ДНК и РНК.
В наше время этот метод в сочетании с компьютерным анализом полученных данных
является ведущим для изучения трехмерной структуры биополимеров.
Радиоактивные изотопы - широко используются для изучения нуклеиновых кислот,
белков, углеводов и других молекул в живой клетке. Радиоизотопы нестабильны и
подвергаются спонтанному распаду, при котором либо происходит гамма-излучение.
Период полураспада варьирует от короткого, как, например, у изотопа 32Р (14 сут), до очень
протяженного, как 14С (5570 лет). Электроны определяют по ионизации газа в счетчике
Гейгера, либо методом радиоавтографии (по их воздействию на серебро, содержащееся в
чувствительном фотоэмульсионном слое).
Радиоактивные молекулы используются при изучении самых разнообразных
внутриклеточных процессов: синтеза молекул из их предшественников, определения
внутриклеточной локализации молекул, времени их функционирования в клетку и ее
отдельных компартментах, химических превращениях в отдельных участках макромолекул
и т.д.
Ультрацентрифугирование (седиментационный анализ) получило широкое
распространение после изобретения в 1926 г. Т. Сведбергом аналитической
ультрацентрифуги, с помощью которой он впервые определил молекулярную массу
гемоглобина (68 кДа).
Хроматография - метод, впервые изобретенный русским ученым М.С. Цветом,
который в 1906 г. фракционировал окрашенные экстракты листьев растений на колонках с
порошком мела.
В настоящее время существует большое количество вариантов хроматографии, в
которых используют матриксы (носители) разных типов, позволяющие разделить белки по
заряду (ионообменная хроматография), размеру молекул (гель-хроматография, чаще
называемая гель-фильтрацией) или способности специфически взаимодействовать с
определенными химическими группами веществ, предварительно связанных с матриксом
(аффинная хроматография). Из всех вариантов хроматографии наибольшей
эффективностью обладает аффинная хроматография (хроматография по сродству), в основе
которой лежит специфическое взаимодействие (указание) молекул взаимодействующих
веществ.
Широкое распространение получила также высокоэффективная жидкостная
хроматография (HPLC).
Электрофорез - в основе этого метода лежит способность белков, обладающих
определенным суммарным положительным или отрицательным зарядом, перемещаться в
электрическом поле в соответствии с величиной заряда, размером и формой молекул.
Электрофорез можно проводить в водном (буферном) растворе, однако, как правило, его
проводят в каком-либо пористом (полимерном) носителе: крахмальном, агарозном или
полиакриламидном геле, на целлюлозных или нитроцеллюлозных пластинах и т.д.
Простейший метод электрофореза на пластинах целлюлозы был использован В.
Ингрэмом в 1956 г. при фракционировании фрагментов протеолитического расщепления
гемоглобина человека, полученных в результате обработки этого белка трипсином. С
помощью данного метода были получены пептидные карты - «фингерпринты» (отпечатки
пальцев), по которым было установлено, что заболевание серповидноклеточной анемией
обусловлено заменой одной-единственной аминокислоты в β-цепи гемоглобина.
Наиболее часто в настоящее время для разделения белков используются метод
электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ), который представляет собой инертный
матрикс с высоким и контролируемым числом поперечных сшивок.
В начале 70-х годов XX в. в Швеции был разработан новый метод разделения белков в
электрическом поле, получивший название изоэлектрофокусирования. В отличие от метода
электрофореза в процессе которого белки фракционируются при каком-то определенном
значении
рН,
задаваемом
электрофоретическим
буферным
раствором,
при
изоэлектрофокусировании белки разделяют в градиенте рН, создаваемом с помощью
специальных реагентов (амфолинов).
Культура клеток - этот метод берет начало с 1885 г., когда впервые было
обнаружено, что клетки куриного эмбриона сохраняют жизнеспособность в солевом
растворе. С 1907 г. стали использовать культуры фрагментов тканей (эксплантов). В
настоящее время используют диссоциированные культуры клеток, из которых можно
получить клетки одного типа.
Бесклеточные системы - незаменимы для изучения механизмов определенных
молекулярных процессов, так как исключают различные побочные реакции, протекающие в
клетке. В 1954 г. П. Замечник получил первую бесклеточную систему для изучения
биосинтеза белка (трансляции).
Моноклональные антитела - очень чувствительный инструмент выявления
(идентификации) молекул в сложных смесях, и поэтому они находят очень широкое
применение в молекулярной биологии. Антитела в целом представляют собой белки
(иммуноглобулины), вырабатываемые позвоночными животными для защиты от
чужеродных соединений антигенов.
Каталитически активные белки (ферменты) - важнейшие инструменты биохимических
методов исследования. Они нашли широкое применение в молекулярной биологии, и
конкретные примеры их использования будут приведены в последующих главах.
Нуклеиновые кислоты как материальные носители наследственных признаков
биологических систем
Нуклеиновые кислоты в той или иной степени были известны исследователям
достаточно давно. Например, в 1847 году немецкий химик Ю. Либих, иностранный членкорреспондент Петербургской академик наук, впервые выделил из мясного экстракта
инозиновую кислоту (монофосфорный эфир инозина). В 1969 году швейцарский врач Ф.
Мишер, исследуя химический состав ядер лейкоцитов, выделил из них вещество, обладавшее
кислыми свойствами, которое он назвал нуклеином. Это событие расценивают как открытие
нуклеиновых кислот, хотя сам термин - нуклеиновая кислота - был виден лишь 30 лет
спустя, в 1899 году. Немногим ранее в 1891 году немецкий биохимик А. Кёссель осуществил
и описал гидролиз нуклеиновой кислоты и показал, что она состоит из остатков сахара,
фосфорной кислоты и четырех гетероциклических оснований, являющихся производными
пурина и пиримидина. Он же впервые доказал существование двух типов нуклеиновых
кислот.
В XX веке началось интенсивное изучение продуктов расщепления нуклеиновых
кислот. Большой вклад в химию пуринов и пиримидинов внес химик-органик Э. Фишер, а
позднее в работах Ф. Левена и Д. Гулланда было давно описание строения углеводных
звеньев в составе нуклеиновых кислот. Используемые и в настоящее время термины
нуклеозид и нуклеотид были предложены Ф. Левеном еще в 1908-1909 годах. Окончательно
химическое строение нуклеозидов и нуклеотидов, а также роль фосфодиэфирной связи в
полимеризации мономерных звеньев нуклеиновых кислот были выяснены в 1952 году
английскими исследователями под руководством А. Тодда.
После открытия того факта, что нуклеиновые кислоты являются полимерами,
состоящими из нуклеотидов четырех типов, с конца 1930-х годов утвердилось мнение, что
полимер нуклеиновой кислоты представляет собой многократно повторяющиеся
тетрануклеотиды, состоящие из всех четырех азотистых оснований. Эта теория,
сформулированная Ф. Левеном, была опровергнута в 1950 году Э. Чаргаффом с
сотрудниками из Колумбийского университета. Чаргафф установил значительные различия в
нуклеотидном составе ДНК из разных источников и сформулировал основные положения,
характеризующие состав нуклеиновых кислот, которые получили название правила
Чаргаффа.
Вершиной исследований строения нуклеиновых кислот явилась модель двойной
спирали ДНК, предположенная в 1953 году американским физиком Ф. Криком. Эта дата
официально считается моментом рождения новой отрасли биологической науки молекулярной биологии. На основании модели ДНК была выдвинута гипотеза
полуконсервативного способа репликации данной молекулы, которая была подтверждена в
1957 году после открытия А. Корнбергом фермента ДНК-полимеразы.
1. Начало работам, приведшим к выяснению биологической роли РНК, было положено в
1930-е годы. Г. Касперсоном и Ж. Браше, которые изучали содержание и
расп23က23еление в клетке нуклеиновых кислот и в первую очередь, РНК.
Значительно позже (в 50-х годах) было показано, что синтез белка осуществляется
рибосомами, но представления о существования РНК-посредника (иРНК),
переносящего информацию от ДНК к рибосомам были сформулированы
французскими генетиками Ф. Жакобом и Ж. Моно только в 1961 году. Главный
фермент транскрипции - ДНК-зависимая - РНК-полимераза был открыт в 1960 году С.
Вейссом, Ж. Гурвицем и О. Стивенсом.
Литература:
Уотсон Дж. Молекулярная биология гена. М.: Мир, 1978.
Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Высшая школа, 1990.
Молекулярная биология: Структура рибосом и биосинтез белка / Под ред. А.С.Спирина. М.:
Высшая школа, 1986.
Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. М.: Высшая школа,
1996.
Вопросы для самоконтроля:
Нуклеиновые кислоты как материальные носители наследственных признаков
биологических систем
Основополагающие открытия молекулярной биологии
Методы молекулярной биологии
Неделя 2
Кредит час 3
Лекция № 2
Тема: Молекулярные механизмы репликации.
Цель: Ознакомить с основными молекулярными механизмами репликации.
Содержание лекции:
Макромолекулы клеток отличаются от малых молекул не только более крупными размерами.
Белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды обладают уникальными свойствами, мало
похожими на те, которыми обладают молекулы, входящие в состав биополимеров в качестве
мономерных звеньев. Биологические макромолекулы построены, как правил, из тысяч,
иногда миллионов атомов, собранных в точно детерминированную пространственную
структуру. Каждая из этих макромолекул несет специфическую информацию, заключенную в
их структуре. Эта информация может быть прочитана при взаимодействии макромолекулой
или одной макромолекулы с другими макромолекулами, что позволяет каждой клетке
выполнять определенные специфические функции.
Макромолекулы обычно имеют молекулярные массы от 10 000 до 1 000 000 дальтон и
более, т.е. по размерам такие молекулы занимают промежуточное положение между малыми
органическими молекулами и надмолекулярными структурами и органеллами. В реакциях
биосинтеза макромолекулы собираются из низкомолекулярных соединений, которые
образуют длинную полимерную цепь. Обычно в построении каждой цепи принимают
участие звенья одного семейства. Поскольку для нормального функционирования каждой
макромолекулы решающее значение имеет точная последовательность мономеров, при
биосинтезе макромолекул должны действовать механизмы, которые однозначно определяли
бы положение каждого мономера в полимерной цепи.
Макромолекулярные цепи образуются с помощью ковалентных связей, которые
достаточно прочны, чтобы поддерживать определенную последовательность мономеров в
составе полимера в течение длительного времени. Но заключенная в этих
последовательностях информация выражается с помощью значительно более слабых
нековалентных связей. Такие слабые взаимодействия возникают между отдельными частями
одной и той же макромолекулы, а также между разными молекулами. В совокупности
слабые взаимодействия определяют и пространственную конформацию макромолекул, и
способы взаимодействия между ними.
Нековалентные связи в биологических молекулах обычно подразделяют на четыре
типа взаимодействий - гидрофобные взаимодействия, ионные взаимодействия, водородные
связи и вандерваальсовы взаимодействия.
В водных растворах каждая нековалентная связь в 30-300 раз слабее, чем типичная
ковалентная связь. Одно слабое взаимодействие в отличие от ковалентной связи слишком
слабо, чтобы противостоять тепловому движению, стремящемуся раздвинуть молекулы в
разные стороны. Поэтому для удерживания двух молекулы вместе требуется большое
количество нековалентных связей. В свою очередь, большое число слабых взаимодействий
может возникнуть между двумя, условно говоря, поверхностями только тогда, когда
большое число атомов взаимодействующих поверхностей точно соответствует друг друга.
Совокупность слабых взаимодействий определяет характер расположения различных
участков одной макромолекулы друг относительно друга и характер взаимодействия одной
макромолекулы с другой или другими. Именно этим объясняется специфичность
биологического узнавания, которое происходит, например, между ферментом и его
субстратом или между комплементарными парами азотистых оснований в молекулах ДНК.
Теоретически, за счет слабых взаимодействий, какой-либо полипептид может
приобретать
огромное
количество
разнообразных
конформаций.
Однако
в
действительности большинство клеточных белков стабильно складываются только одним
способом. Дело в том, что в ходе эволюции была отобрана такая последовательность
аминокислот, при которой образуется наиболее благоприятный единственный комплекс
слабых взаимодействий, обеспечивающих единственно правильную конформацию.
И еще одна важная особенность структуры макромолекул. Как уже упоминалось,
биологические полимеры, а также различные структуры часто образованы путем
соединения похожих друг на друга мономерных единиц, таких, как аминокислоты или
нуклеотиды, в длинную полимерную цепь. Анализ строения биополимеров с помощью
различных физико-химических методов показал, что сборка мономеров в виде прямой
линии явление чрезвычайно редкое. Общим структурным элементом биологических
макромолекул, построенных из повторяющихся мономеров, является спираль. В
зависимости от направления закручивания различают спирали правые (вращение по
часовой стрелке) и левые (вращение против часовой стрелки). Направление хода спирали
не изменяется при ее переворачивании, но изменяется при зеркальном отображении.
Спиральная форма характерна для подавляющего большинства биополимеров клетки.
Примерами могут служить а-спирализованные участки в молекулах белков, двойная
спирализация молекул ДНК, формирование шпилечных структур молекулами РНК и
образование пространственной конформаций тРНК, а также спиральная конформация
молекул амилозы с шестью остатками a-D-глюкопиранозы на один виток спирали и
спирализация отдельных участков в молекулах гликогена с 5.82 остатками глюкозы на один
виток и расстоянием между витками равным 2,07 нм.
Доказательства генетической роли нуклеиновых кислот
Методами формальной генетики было установлено, что ген является дискретным
фактором наследственности, представляет собой часть хромосомы и что он переходит от
родителя к потомку, т.е. передается в ряде поколений.
Решающий роль в выяснении природы гена сыграло представление о том, что ген
отличается от; признака, который он определяет. До начало 40-х годов было лишь известно,
что ген - это действительно основные единицы наследственности, но каким путем они
выполняют свою функцию, оставалось неясным. Гены можно было характеризовать, исходя
из мутаций, вызывающих некоторые отклонения от нормы в фенотипе. Почти во всех
случаях эффект мутаций анализировали только на описательном уровне. Идея о том, что
эффект мутаций связан с появлением измененного фермента возникла в начале XX
столетия. В своих работах, проведенных в 1902-1908 годах, Арчибальд Гэррод высказал
мнение, что болезнь человека - алкаптонурия - обусловлена нарушением какой-то
метаболической реакции, катализируемой ферментом. Его книга «Врожденные ошибки
метаболизма» была для своего времени самым ярким и важным вкладом в биологию и
медицину. Фраза А. Гэррода - «расщепление бензольного кольца в ходе нормального
метаболизма - результат действия специального фермент отсутствует» - заключает в себе
концепцию, согласно которой генетический дефект может привести к нарушению
определенного метаболической процесса, что находит свое отражение в наблюдаемом
фенотипе. Таким образом, к определенному моменту сформировались взгляды относительно
того, что различные мутации влияют на фенотип посредством препятствия синтеза какоголибо белка. В 1941 году Дж. Бидл и Э. Тейтем, основываясь на данных по изучению
мутантных штаммов хлебной плесени Neurospora crassa, сформулировали важнейший
принцип - один ген - один белок (один фермент).
Физическая же и химическая природа генетического материала оставалась
неизвестной.
Значительным толчком к изучению и пониманию природы гена послужил Е.
Шредингера, опубликованный в 1945 году.
Самый первый и наиболее яркий пример, демонстрирующий роль ДНК
как вещества: наследственности, относится к 1928 году. Явление, получившее название
трансформации, впервые было обнаружено бактериологом Фредериком Гриффитом при
изучении пневмококковой инфекции у мышей.
В 1944 году Освальд Эйвери, Колин Мак-Леод и Маклин Мак-Карти опубликовали
результаты своих классических исследований.
Следующее доказательство генетической роли ДНК было получено в 1952 году в
экспериментах, проведенных на совершенно другой системе. Альфред Херши и Марта Чейз
инфицировали клетки Е. coli фагом Т2, у которого радиоактивным изотопом 32Р была
помечена ДНК. а изотопом 35S помечены белки капсида. Эксперимент был построен на том
свойстве фага, что при добавлении его к бактериальной культуре он адсорбируется на
поверхности клеток, вводит определенное вещество в бактериальную клетку и затем, через
некоторое время, клетка лизируется, давая большое число фаговых потомков.
В результате описанных выше экспериментов стало ясно, что, по крайне мере, у
бактерий и фагов генетическим материалом служит ДНК. Но как обстоит дело у высших
организмов, у эукариотических клеток?
Первые доказательства были получены, когда удалось экспериментально показать, что
хромосомы можно выделить из одной клетки и перенести в другие, просто смешав их с этими
клетками. С очень низкой частотой в реципиентных клетках начинали проявляться признаки
клетки-донора, внесенные посредством хромосомы. Впоследствии появилась возможность
выполнить такую процедуру с очищенной ДНК, а теперь, увеличивая чистоту
трансформирующего отдельные чистые гены, т.е. ДНК, содержащую только тот ген,
который был утрачен этими клетками. Затем можно получить трансформантов, содержащих
и экспериментирующих данный ген.
Принципиальная организация ДНК.
Модель ДНК Уотсона и Крика
Открытие двойной спирали ДНК было одним из самых выдающихся событий
молекулярной биологии. В основу модели ДНК, построенной в 1953 году Джемсом
Уотсоном и Фрэнсисом Криком, легли две группы фактов: во- первых, результаты
предшествующего анализа количественного соотношения четырех оснований в составе
ДНК из разных источников, полученные Эрвином Чаргаффом и, во-вторых, анализ картин
дифракции рентгеновских лучей на нитях ДНК, полученных Розалиндой Франклин и
Морисом Уилкинсом.
Закономерности, выявленные Э. Чаргаффом, были впоследствии сформированы в виде
правил.
а) состав ДНК различных клеток, составляющих ткани и органы одного организма,
всегда одинаков;
б) состав ДНК клеток организма с возрастом не изменяется;
в) состав ДНК клеток разных видов различен;
г) количество аденина всегда равно количеству тимина (А=Т), а количество гуанина
равно количеству цитозина (G=C);
д)сумма пуриновых оснований равна сумме пиримидиновых оснований (A+G=T+C).
Следовательно, любая молекула ДНК может быть охарактеризована по ее составу как
отношение (G+C)/(A+T), которое, изменяясь от 26 до 74 мольных %, остается
характерным для каждого вида.
Данные рентгеноструктурного анализа показали, что ДНК имеет форму регулярной
спирали диаметром 20А, делающей один полный оборот каждые 34 А (3,4 нм). Поскольку
расстояние между соседними нуклеотидами в цепи составляло 3,4 А (0,34 нм), то одном
витке должно быть 10 нуклеотидов.
Плотность ДНК свидетельствовало о том, что спираль должна состоять из двух
полинуклеотидных цепей. Одновременно, постоянный диаметр спирали предполагал, что в
каждой цепи азотистые основания направлены внутрь спирали, причем расположены так,
что пуриновое основание взаимодействует с пиримидиновым, обеспечивая ситуацию, при
которой невозможно образование контактов пурин-пурин и пиримидин-пиримидин.
Дж. Уотсон и Ф. Крик предположили, что две полунуклеотидные цепи в молекуле ДНК
не связаны ковалентно, а соединяются водородными связями, возникающими между
азотистыми основаниями. Реакции взаимодействия G с С и А с Т получили название
спаривания оснований, а основания, способные образовывать пары, получили название
комплементарных. В А-Т паре основания соединены двумя водородными связями: одна из
них образуется между амино- и кетогруппами, а другая - между двумя атомами азота пурина
и пиримидина, cooтветственно. В G-C паре имеются три водородные связи: две из них
образуются между амино- и кетогруппами соответствующих оснований, а третья - между
атомами азота.
Для осуществления специфического спаривания основания должны находиться в
соответствующей таутомерной форме. Миграция водородного атома позволяет каждому
основанию существовать в различных таутомерных формах. Основания, входящие в состав
двойной спирали ДНК и образующие канонические пары, должны иметь аминогруппы (NH2) и кетогруппы (>С—О) в отличие от таутомеров, имеющих иминогруппы (=NH) и
енольные группы (-ОН) и способных к неканоническому спариванию, как, например,
пуриновое основание аденин, который может образовать пару с таутомерной формой
цитозина.
Действительно, образование пар между двумя пуринами, двумя пиримидинами или
некомплементарными основаниями А-С или G-T затруднено, поскольку при этом не могут
образовываться подходящие водородные связи и, следовательно, нарушается геометрия
спирали. Модифицированные пурины и пиримидины, с небольшой частотой встречающиеся
в ДНК, образуют такие же водородные связи, что и их немодифицированные аналоги. В
этом случае правило спаривания не нарушается.
Согласно модели двойной спирали две полинуклеотидные цепи в молекуле ДНКантипараллельны, т.е. идут в противоположенных направлениях. Поэтому, рассматривая
спираль вдоль оси, можно видеть, что она цепь идет в направлении 5'—»3', а другая - в
направлении 3'—>5'.
Основания имеют плоскую форму и располагаются парами в плоскости,
перпендикулярной оси спирали. Вдоль спирали основания уложены стопками друг на
друга и стабилизация спиральной структуры дополнительно обеспечивается
межплоскостными взаимодействиями между ароматическими кольцами соседних
оснований. Эти специфические контакты получили название стэкинг-взаимодействий,
которые являются результатом реализации вандервальсовых сил, возникающих за счет
перекрывания π-облаков над и под двойными связями ненасыщенных колец пуринов и
пиримидинов, с одной стороны, и гидрофобных, взаимодействий - с другой.
Каждая пара оснований повернута на 36° вокруг оси спирали относительно
следующей пары, и таким образом 10 пар оснований составляют один полный оборот в
360°. Две цепи, образующие двойную спираль, уложены таким способом, что наблюдаемая
структура характеризуется наличием малой бороздки шириной 12 А и большой бороздки
шириной 22 А. Двойной спираль правосторонняя: если смотреть вдоль оси спирали повороты следуют по часовой стрелке. Данное описание соответствует модели ДНК,
известной как В-форма.
Одно из обязательных требований к генетическому материалу состоит в том, что он
должен быть способен к точному самовоспроизведению при каждом клеточном делении.
По этому поводу в своих пионерских работах Дж. Уотсон и Ф.Крик сделали классический
вывод: «Нельзя не заменить, что постулированное нами специфическое взаимодействие
непосредственно предполагает возможность копирования генетического материала».
Эти идея базировалась на том представлении, что соединение двух
полинуклеотидных цепей только водородными связями должно позволять им разделяться.
Предлагая модель молекулы ДНК, Дж. Уотсон и Ф. Крик постулировали также
механизм репликации ДНК. в соответствии с которым каждая исходная цепь может
служит матрицей для синтеза комплементарной дочерней цепи. Такой механизм удвоения
ДНК был назван полуконсервативным.
Литература:
2. Уотсон Дж. Молекулярная биология гена. М.: Мир, 1978. Молекулярная биология
3. Молекулярная биология. Учебное пособие для студентов медицинских вузов
Автор: Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Изд-во: Медицинское информационное
агентство, 2007. С. 536
4. Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Академия, 2011.
5. Бокуть С.В., Герасимович Н.В., Милютин А.А. Название: Молекулярная биология,
изд-во:Вышэйшая школа, Год: 2005
Вопросы для самоконтроля:
1. Доказательства генетической роли нуклеиновых кислот
2. Принципиальная организация ДНК. Модель ДНК Уотсона и Крика
Неделя 3
Кредит час 5
Лекция № 3
Тема: Структура и функции РНК.
Цель: ознакомить со структурой и функциями РНК
Содержание лекции:
Содержание РНК в любых клетках в 5-10 раз превышает содержание ДНК. Основная роль
РНК состоит в трансляции генетической информации с образованием белков, а также в
осуществлении некоторых специализированных эндонуклеазных функций, возможно
регулирующих различные этапы экспрессии генов. Геномы некоторых вирусов (ретровирусов
и множества вирусов животных, растений и насекомых) представлены одно- и
двуцепочечной молекулой РНК.
Виды РНК. Во всех клетках присутствуют следующие виды РНК: рибосомная
(рРНК). транспортная (тРНК) и информационная, или матричная (мРНК). Большинство
клеток содержат много малых цитоплазматических РНК (мцРНК), а в клетках эукариот
присутствуют малые ядерные РНК (мяРНК).
Около 80-85% массы клеточных РНК составляют три (прокариоты) или четыре вида
рРНК, около 10% - почти 100 видов тРНК. На долю нескольких тысяч различных
матричных РНК приходится менее5% клеточной РНК, число видов которых пока
неизвестно, - менее 2% от общего количества РНК.
Вид РНК
Приблизительное
число разных видов
в клетках
Транспортная РНК (тРНК)
80-100
Рибосомная 5S РНК
(рРНК)
1-2
Приблизительная
длина (число
нуклеотидов)
75-90
120
Распространеннос
ть
П, Э
П, Э
Рибосомная 5,8S РНК
(рРНК)
Рибосомная
16SPHK(pPHK)
Рибосомная 23S РНК
(рРНК)
Рибосомная 18S РНК
(рРНК)
Рибосомная 28S РНК
(рРНК)
Матричная РНК (мРНК)
1
158
Э
1
1600
П
1
3200
П
1
1900
Э
1
5000
Э
Тысячи
Варьирует
П,Э
Варьирует
Э
90-330
П,Э
58-220
Э
Гетерогенная ядерная
Тысячи
РНК (гяРНК)
Малая
Десятки
цитоплазматическая
РНК(мцРНК)
Малая ядерная РНК
Десятки
(мяРНК)
а. П - прокариоты, Э – эукариоты
Макромолекулярная структура РНК
Двутяжевые
РНК,
построенные
из
двух
комплементарных
полинуклеотидных цепей, обнаруживаются только в составе некоторых вирусов. Кроме того,
известны однотяжевые РНК (вироиды). состоящие, по сути дела, из двух комплементарных
нуклеотидных последовательностей и поэтому существующие в видедвуспиральных
молекул.
В двойной спирали РНК возможна только одна, С3' - эндо - конформация остатка
рибозы. Поэтому двуспиральные РНК, также комплементарные двутяжевые
полирибонуклеотидные комплексы [типа поли (А)-поли (U)] существуют только в правой Аформе, в основных чертах подобной А-форме ДНК.
Общие черты вторичной структуры однотяжевых РНК. Макромолекулы
большинства природных РНК построены из одной полирибонуклеотидной цепи. Основной
элемент их вторичной структуры сравнительно короткие двойные спирали, образованные
комплементарными участками одной и той же цепи и перемежающиеся ее однотяжевыми
сегментами. Полирибонуклеотидные цепи в таких двуспиральных структурах (спирализация
сама на себя) антипараллельны, а сами двойные спирали, находящиеся в А-форме, не
идеальны: в них имеются дефекты в виде неспареннных нуклеотидных остатков или не
вписывающихся в двойную спираль однотяжевых петель. Наряду с классическими ссоцикриковскими парами (AU и GC) в двутяжевых участках РНК часто встречается пара GU.
Таким образом, стабильность двутяжевых районов поддерживается комплементарными и
межплоскостными взаимодействиями оснований. В однотяжевых участках наблюдаются
сильные стэкинг-взаимодействия оснований, вследствие чего они стремятся принять
конформацию однотяжевой спирали.
Третичная структура однотяжевых РНК. При исследованиях макромолекулярной
организации однотяжевых РНК было установлено, что в физиологических условиях они
характеризуются компактной и упорядоченной третичной структурой, которая возникает за
счет взаимодействия элементов их вторичной структуры.
1. Элементы вторичной структуры РНК располагаются друг относительно друга так,
чтобы обеспечить максимальный стэкинг оснований в макромолекуле в целом.
2. Контакты между отдельными элементами вторичной структуры осуществляются за
счет нескольких типов так называемых «третичных» внутримолекулярных
взаимодействий:




за счет образования дополнительных зачастую не Круковских пар оснований
между нуклеотидными остатками удаленных друг от друга (первичной и вторичной
структурах) однотяжевых участков и триплетов оснований между нуклеотидными
остатками однотяжевых и двутяжевых элементов. При анализе вторичных структур
вирусных и рибосомных РНК было обнаружено, что однотяжевые участки в
вершине петель в принципе могут давать двуспиральные комплексы с
межпетельными однотяжевыми сегментами с образованием «псевдоузлов».
за счет дополнительных («третичных») стэкинг-взаимодействий после
интеркаляции (внедрения) оснований одного участка между двумя соседними
основаниями другого однотяжевого участка.
за счет образования дополнительных водородных связей между 2'ОН - группами
остатков рибозы и основаниями, а также другими группами пентозофосфатного
остова.
Третичная структура РНК стабилизирована ионами двухвалентных металлов,
которые связываются не только с фосфатными группами, но и с основаниями.
Транспортные РНК
Главной функцией транспортных РНК (тРНК) является акцептирование аминокислот и
перенос их в белоксинтезирующий аппарат клетки. Они выступают в роли затравки
(праймера) в процессе обратной транскрипции.
Последовательность тРНК включает 70-90 нуклеотидов и около10% минорных
компонентов. Она образует вторичную структуру, известную под названием «клеверный
лист». Эта структура состоит из 4 или 5 двуцепочечных спиральных стеблей и трех петель.
Каждый стебель содержит 4-7 уотсон-криковских пар, образующих двойные спирали.
Различают акцепторный, антикодоновый, дигидроуридиловый (D), псевдоуридиловый
(ТТрС) и добавочный стебли. Акцепторный стебель содержит 3'- и 5'- концы
полинуклеотидной цепи, причем к концевой 3' - гидроксильной группе (ССАЗ'ОН)
присоединяются
специфическая
аминокислота,
отвечающая
последовательности
антикодонового триплета в антикодоновой петле. Число нуклеотидов в стеблях и петлях
почти постоянно у разных тРНК за исключением вариабельных петель (от 4 до 21
нуклеотида).
Транспортные
РНК
единственные
представители
природных
полирибонуклеотидов, которые удалось закристаллизовать и изучить методом
рентгеноструктурного анализа с достаточно высоким разрешением. Наиболее детально
обработана третичная структура дрожжевой тРНК1'1''.
В последовательности тРНК имеются инвариантные основания, т.е. основания,
присутствующие во всех тРНК. Они участвуют главным образом, в «третичных
взаимодействиях», которые возникают тогда, когда молекула тРНК сворачивается в
нативную Г-образную структуру. Г-форма состоит из двух почти перпендикулярных друг
другу спиралей А-РНК, длина которых составляет около 7 нм, толщина - 2 нм.
Одну спирали образуют уложенные друг за другом антикодоновый и дигидроуридиловый
стебли, другую - акцепторный и псевдоуридиловый стебли
Третичные взаимодействия включают стэкинг (у т-рнкphe из 76 оснований в стэкингвзаимодействиях участвует 71 основание); интеркаляцию и необычное спаривание
оснований, при котором образуются не только пары, но и триплеты. Большая часть
стабилизирующих третичную структуру водородных связей образуется между
инвариантными полувариантными основаниями.
Особым видом стэкинга является интеркаляция (отдельных местах основание из
одной цепи встраивается между двумя основаниями другой цепи). Такое взаимодействие
осуществляется там, где встречаются сразу три цепи. Пентозофосфатный остов в месте
вставки основания перестраивается путем изменения конформации сахара СЗ'-эндо—>С2' эндо-, в результате чего увеличивается расстояние между фосфатами (от 0,59 нм до 0,70 нм),
и это способствует интеркаляции.
Антикодон имеет жесткую архитектуру, которая позволяет ему быстрое считывать
матричную РНК.
Рибосомные РНК
Высокомолкулярные рибосомные РНК (рРНК) являются структурной основой для
формирования рибонуклепротеинового тяжа, который, складываясь в пространстве, дает
начало 30-40 S- и 50-60 S-субчастицам рибосомы; рРНК взаимодействуют с мРНК и
аминоацил - тРНК в процессе трансляции. Низкомолекулярная 5SpPHK в комплексе с
рибосомными
белками
формирует
комплекс,
который
называют
третьей субчастей рибосомы, где 5SpPHK выступает в роли посредника между
пептидилтрансферазным центром и EF-G-связывающими доменами.
Детально изучены первичная, вторичная и третичная структуры 5SpPHK.
Выяснены первичные структуры 16-18 SpPHK и 23-25SpPHK ряда организмов.
Вторичная структура рРНК характеризуется спирализацией самой на себя
полирибонуклеотидной цепи. Биспиральные и линейные участки этих молекул формируют
постоянные и вариабельные домены, которые затем укладываются в более компактные
структуры высшего порядка.
Матричные РНК
Матричное (мРНК) считают РНК, которая в последовательности нуклеотидных
остатков в молекуле несет информацию, обеспечивающую синтез специфического белка
непосредственно на ней самой, а также информацию о времени, количестве, месте и
условиях синтеза этого белка.
Строение мРНК эукариот специфично: в них составе есть информативные, т.е.
работающие как матрицы в процессе биосинтеза елка, зоны и неинформативные участки.
Отмеченное своеобразие в строении мРНК и расположение функциональных участков в ее
молекуле представлены в виде обобщенное структуры. Неинформативные участки
содержат кэп, 5' -нетранслируемую область (5'НТО), 3' -нетранслируемую область (З'НТО),
полифеноловый фрагмент.
Кэп (от англ. кепка, шапка) - нуклеотидная последовательность, содержащая 7метилгуанозин, присоединенный через трифосфатную группировку к первичному
транскрипту. Кэп часто включает 2' – О - метильные группы, связанные с первым или
с двумя первыми рибозными остатками последуемых нуклеотидов. Кэп нужен для
защиты мРНК от экзонуклеаз, а также для связывания белковых факторов при
взаимодействии с рРНК в рибосоме (играет сигнальную роль в присоединении мРНК к
рибосоме и участвует в трансляции).
Длина поли (А) - фрагментов у разных мРНК колеблется от 50 до 400 н.п. Эти
фрагменты отсутствуют в молекулах гистоновых мРНК. Полагают, что полиадениловая
часть молекулы мРНК участвует в процессе созревания мРНК, предопределяет время
жизни мРНК, способствует переносу мРНК из ядра в цитоплазму и принимает участие в
трансляции.
Время полужизни мРНК в клетке, как и момент их деградации, запрограммированы
специфическими последовательностями часто в их З'НТО. Их называют элементами
нестабильности мРНК. Определенные белки клетки узнают эти последовательности,
связываются с ними и стабилизируют мРНК. Кроме этого З'НТО содержат сигналы
цитоплазматического и ядерного полиаденилирования и сигналы внутриклеточной
локализации для этих мРНК. Интересно отметить, что информация об одном и том же
свойстве мРНК может содержаться в разных частях молекулы мРНК, иногда отстоящих
друг от друга вдоль полинуклеотидной цепи на значительном расстоянии. Вероятно, эти
участки молекулы мРНК сближаются при формировании ее пространственной структуры.
Предполагают, что вторичная (спирализация сама на себя) и третичная структуры менее
компактны, чем для тРНК и рРНК.
Гетерогенная ядерная РНК
Гетерогенная ядерная РНК (гяРНК) - смесь транскриптор многих ядерных генов;
локализована в ядре. Некоторые из них являются первичными транскриптами и имеют
такую же длину, как и гены, с которых они скопированы, другие - частично
процессированы и утратили ряд интронов.
Малые ядерные РНК
Все эукариотические клетки содержат множество малых ядерных РНК (мяРНК)
коротких стабильных молекул РНК, большинство которых в составе нуклеопротеидных
частиц присутствуют в ядре. Они обнаружены в составе сплайсингом млекопитающих Эти
РНК называют U-PHK из-за необычайно большого содержания урацила и его
модифицированных форм. Нуклеотидные последовательности всех U-РНК позвоночных
совпадают на 95%.
U-PHK млекопитающих
U-PHK
Длина
РНК
(число
Функция
нуклеотидов)
U1
164
Сплайсинг про-мРНК
U2
187
Сплайсинг про-мРНК
217
Процессинг про-рРНК в ядрышке
U3
U4
145
Сплайсинг про-мРНК
U5
116
Сплайсинг про-мРНК
U6
106
Сплайсинг про-мРНК
U7
65
Образование 3'-концов гистоновых
мРНК
U11
131
Полиаденилирование про-мРНК
Малые цитоплазматические РНК
Функции малых цитоплазматических РНК (мРНК), за исключением 7SL-PHK сигналраспознающих частиц, не установлены. Известно, что большинство этих РНК
ассоциированы с крупными семействами последовательностей, содержащими как гены, так
и псевдогены.
В переносе новосинтезированных, секретируемых и связанных с мембранами
полипептидов через липидный слой эндоплазматического ретикулума участвуют
сигналраспознаующие частицы, основным компонентом которых является 7SL-PHK.
Нуклеотидные последовательности 7SL-PHK у грызунов и приматов практически
одинаковы, а у дрозофилы эта РНК на 64% гомологична соответствующей РНК человека.
Малые цитоплазматические РНК
РНК
Организмы
Длина РНК (число
нуклеотидов)
7SL
Позвоночные
300
7S
Беспозвоночные
254
7SK
Беспозвоночные
330
4,5S
Грызуны
90-94
Литература:
1. Молекулярная биология. Учебное пособие для студентов медицинских вузов Автор:
Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Изд-во: Медицинское информационное агентство,
2007. С. 536
2. Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Академия, 2011.
3. Бокуть С.В., Герасимович Н.В., Милютин А.А. Название: Молекулярная биология,
изд-во:Вышэйшая школа, Год: 2005
Вопросы для самоконтроля:
1. Макромолекулярная структура РНК Транспортные РНК
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Рибосомные РНК
Матричные РНК
Гетерогенная ядерная РНК
Малые ядерные РНК
Малые цитоплазматические РНК
U-PHK млекопитающих
Неделя 4
Кредит час 7
Лекция № 4
Тема: Созревание РНК: процессинг и сплайсинг.
Цель: ознакомить с процессом созревания РНК
Содержание лекции:
Процесс формирования зрелых (т.е. функционально активный) молекул РНК из
предшественников, называемый процессингом, - важнейший этап образования многих видов
эукариотических иРНК. Все стабильные РНК бактерий также синтезируются в виде
первичных транскриптов, из которых замет образуется зрелые рРНК или тРНК. Аналогичным
путем происходит образование и эукариотических рРНК и тРНК.
В отличие от эукариотических, большинство бактериальных иРНК представляют собой
первичные транскрипты, которые в состоянии непосредственно взаимодействовать с
рибосомами, так что только в очень редких случаях их трансляции должен предшествовать
процессинг.
У эукариот, напротив, образование зрелой иРНК, кодируемой прерывистым геном, наиболее сложный процесс из всех видов процессинга, обеспечивающий большое число
реакций сплайсинга, обеспечивающих соединение экзонов путем удаления интронов. Все
реакции процессинга являются высокоспецифичными, что приводит к образованию зрелых
молекул РНК с уникальными 5'- и 3'- концами.
Эндонуклеотические и экзонуклеотические ферменты
Реакции процессинга осуществляются специфическими рибонуклеазами. способными
расщеплять фосфодиэфирные связи в молекулах РНК. Как любые другие нуклеазы,
рибонуклеазы, участвующие в процессинге разделяют на две класса: экзонуклеазы и
эндонуклеазы.
Эндонуклеазы расщепляют определенные связи внутри молекул РНК, что приводит к
образованию более коротких фрагментов. Эти ферменты участвуют в реакциях разрезания
молекул РНК, в которых нуклеотидные последовательности, соответствующие зрелой РНК,
отделяются от концевых последовательностей.
Экзонуклеазы удаляют остатки нуклеотидов с конца молекулы по одному с
образованием мононуклеотидов. По способу воздействия на субстрат экзонуклеазы
подразделяют
на
ферменты, действующие случайно или последовательно. Фермент,
действующий на РНК-субстрат случайным образом, удаляет концевой нуклеотид из одной
молекулы РНК и затем диссоциирует из фермент-субстратного комплексе с РНК. В ходе
следующего каталитического акта фермент может атаковать либо ту же самую, либо другую
молекулу РНК-субстрата. При последовательном отщеплении нуклеотидов фермент остается
связанным с одной и той же РНК и удаляет один нуклеотид за другим с целью
подравнивания молекул РНК. Все охарактеризованные к настоящему времени экзонуклеазы
подравнивают молекулы РНК за счет удаления избыточного материала, расположенного на
3'- конце. Удаление материала с 5'- конца происходит посредством разрезания с участием
эндонуклеаз.
Помимо участия в специфических реакциях созревания рибонуклеазы осуществляют
деградацию «избыточной» РНК. К таким «избыточным» молекулам относятся зрелые РНК,
которые уже выполнили; свои функции, а также материал, который образовался при
разрезании предшественников. Рибонуклеазы, участвующие в таких превращениях, менее,
специфичны, чем рибонуклеазы, участвующие в определенных реакциях созревания,
поскольку их функция заключается в полном разрушении РНК, а не в образовании
специфических концов.
В действительности рибонуклеазы сильно различаются по своей субстратной
специфичности. Вместе с тем не описана ни одна эндорибонуклеаза, которая бы
действовала на характерные последовательности из нескольких нуклеотидов. По этой
причине их нельзя рассматривать как аналоги рестриктаз, узнающих именно специфические
последовательности в ДНК, подлежащие расщеплению. Многие эндорибонуклеазы
обладают некоторой небольшой специфичностью в том смысле, что они расщепляют
фосфодиэфирные связи в местах расположения определенных оснований. Однако они
значительно более специфичны по отношению к конформации РНК-субстрата. Таким
образом, характерной особенностью эндорибонуклеаз является не то, что они узнают
определенные последовательности, как рестриктазы, а проявляют специфичность по
отношению к конформации молекулы РНК, т.е. к тем участкам, которые образуют
вторичные и третичные структуры, подобные шпилькам структурам в целом, характерным,
например, для тРНК.
Нуклеазы различаются как по своей ферментативной активности, так и субстратной
специфичности. Фосфодиэфирные связи, соединяющие два нуклеотида, могут быть
расщеплены с любой стороны от фосфатной группы.
При разрыве связи по одну сторону от фосфатной
группы образуются 3'гидроксильный и 5'- фосфатный концы. Внесение разрыва по другую сторону фосфатной
группы приводит к образованию 3'-фосфатных и 5'- гидроксильных концов.
К числу эндонуклеаз, расщепляющих молекулы РНК с формированием 3'- фосфатных
и 5'-гидроксильных концов относятся панкреатическая рибонуклеаза и рибонуклеаза Т!,
получаемая из Aspergillus oryzae. Рибонуклеаза Т1 была обнаружена также в клетках
других грибов и бактерий.
Панкреатическая рибонуклеаза А специфически гидролизует межнуклеотидные связи
предпочтительно в однонитевых РНК по пиримидиновым основаниям. Конечными
продуктами гидролиза являются пиримидиновые нуклеозид -3'- фосфаты и
олигонуклеотиды. содержащие 5'-ОН- и 3'- фосфатную группу.
Рибонуклеаза А образована одной полипептидной цепью, содержащей 124
аминокислотных остатка, а ее молекулярная масса равна 13 600 дальтон. РНКаза А является
первым ферментом, для которого была установлена первичная структура. Кроме того, в 1969
году методом твердофазного синтеза на полимерном нерастворимом носителе
(микропористый хлорметилированный сополимер стирола и дивинилбензола) Роберт
Меррифилд осуществил полный химический синтез каталитически активного фермента.
Результаты данной работы со всей очевидностью продемонстрировали, что именно
последовательность аминокислот определяет трехмерную структуру белка. В определенных
условиях РНКаза А может быть фрагментирована под действием субтилизина,
расщепляющего пептидную связь Ala -20 - Ser-21. Образующиеся фрагменты были названы
S-пептидом (остатки 1-20) и S-белком (остатки 21-124). Полученные фрагменты за счетнековалентных взаимодействий образуют комплекс, названный РНКазой S. Этот комплекс
обладает в" отличие от изолированных фрагментов практически полной каталитической
активностью.
Рибонуклеаза Т1 из Aspergillus oryzae осуществляет расщепление межнуклеотидных
связей в одноцепочечных РНК по гуаниновым остатком, образуя гуанозин -3'- фосфаты и
олигонуклеотиды, имеющие на 5'- конце гидроксильную группу, а на 3'- концах - гуанозин3'- фосфаты.
Рибонуклеаза Т2 из A. oryzae при длительном гидролизе РНК расщепляет ее
полностью до нуклеозид - 3'- фосфатов. При частичном расщеплении РНК образуются
преимущественно фрагменты, содержащие на 3'- концах аденозин-3'- фосфаты.
Среди других ферментов, расщепляющих РНК, следует упомянуть рибонуклеазу III из
Е.
coli,
проявляющую
абсолютную
специфичность
к
двухцепочечным
полирибонуклеотидам. Фермент дает олигонуклеотиды, оканчивающиеся 3'- фосфатом.
До того момента как появились современные методы секвенирования нуклеиновых
кислот, указанные выше ферменты использовали для расщепления РНК до
олигонуклеотидов
различной
длины
с
целью
определения
нуклеотидной
последовательности блочным способом. Наиболее широкое распространение приобрели
методы неполных расщеплений РНК маркируют путем введение радиоактивной метки
(обычно это 32Р) с помощью полинуклеотидкиназы для 5'-конца или РНК-лигазы для З'конца. Затем меченую РНК разделяют на четыре порции и каждою порцию подвергают
неполному расщеплению одной из специфических рибонуклеаз. Продукты гидролиза в
каждой порции, представляющимися последовательностями, наносят в лунки
полиакриламидного
геля,
подвергают
электрофоретическому
разделению
и
радиоавтографируют. Последовательность нуклеотидов в РНК читают непосредственно с
радиоавтографа, поскольку каждая из четырех дорожек соответствует набору
олигонуклеотидов, полученных при расщеплении молекулы по определенному остатку.
Недостатком метода является малая специфичность рибонуклеаз к определенному типу
оснований (например, рибонуклеаза Т2), а также зависимость скорости расщепления от
типа основания. Вследствие этого приходится использовать набор различных рибонуклеаз с
перекрывающейся специфичностью. Именно в силу низкой специфичности описанных
выше рибонуклеаз есть все основания полагать, что данные ферменты ответственны за
деградацию РНК in vivo.
В естественном состоянии все молекулы РНК полярны: на 3'- конце находится
гидроксильная группа, а 5'- конец фосфорилирован (на этом конце, в зависимости от типа
модификации, может находиться трифосфат. монофосфат или даже «кэп»). Ферменты,
участвующие в процессинге РНК, образуют такие же концы. Таким образом, воздействие
на РНК всех ферментов процессинга, как разрезающих молекулу изнутри, так и
отщепляющих концевые нуклеотиды, приводит к образованию окончательных 5'фосфатных и 3'- гидроксильных концов.
Литература:
1. Молекулярная биология. Учебное пособие для студентов медицинских вузов Автор:
Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Изд-во: Медицинское информационное агентство,
2007. С. 536
2. Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Академия, 2011.
3. Бокуть С.В., Герасимович Н.В., Милютин А.А. Название: Молекулярная биология,
изд-во:Вышэйшая школа, Год: 2005
Вопросы для самоконтроля:
1. Эндонуклеотические и экзонуклеотические ферменты
Неделя 5
Кредит час 9
Лекция № 5
Тема: Биосинтез белка
Цель: ознакомиться с процессом биосинтеза белка
Содержание лекции:.
Биосинтез белка (трансляция) - важнейший этап реализации генетической программы
клеток, в процессе которого информация, закодированная в первичной структуре
нуклеиновых кислот, переводится в аминокислотную последовательность синтезируемых
белков. Иными словами, трансляция - это перевод четырехбуквенного (по числу
нуклеотидов) «языка» нуклеиновых кислот на двадцатибуквенный (по числу
протеиногенных аминокислот) «язык» белков. Перевод осуществляется в соответствии с
правилами генетического кода. Трансляция происходит с участием специализированных
внутриклеточных частиц - рибосом, и в ее осуществлении принимает участие три главных
класса РНК (мРНК, рРНК и тРНК). а также большая группа особых белковых факторов
трансляции. Особенности молекулярного аппарата и механизм трансляции изучены в
основном на прокариотических объектах (бактериях и бактериофагах), однако есть все
основания считать, что основные принципы трансляции реализуются и в эукариотических
клетках, в которых в то же время более развиты механизмы регуляции
белоксинтезирующей системы.
Генетический код
Изучение трансляции и прежде всего расшифровка генетического кода стали одной из
наиболее ярких страниц молекулярной биологии второй половине XX в. Еще в начале 50-х
годов Г. Гамов предложил, что генетический код является триплетным: три соседних
нуклеотида в полинуклеотидной цепи программируют включение одной аминокислоты в
полипептидную цепь белка. В середине 60-х годов в серии оригинальных экспериментов Ф.
Крик, С. Бреннер, Г. Вйтман и другие исследователи действительно установили, что код
является триплетным и непрерывным (не содержит «запятых»), т.е. в процессе синтеза белка
последовательность мРНК считывается последовательно группами по три нуклеотида.
Полная расшифровка генетического кода, проведенная М. Ниренбергом, С. Очаоа и Г
Корана с использованием бесклеточных; систем, содержащих рибосомы и специальные
синтетически полученные матрицы определенного строения, была закончена в 1966 г. В
соответствии с кодом при использовании кополимера поли (UC)n в качестве матрицы в этих
системах образовался полипептид, построенный из остатков серина и лейцина, а поли (UG)
п служил матрицей для синтеза сополимера с чередующимися остатками Val и Cys. Эта
работа показала, что 61 из 64 возможных сочетаний трех нуклеотидов четырех типов (4x4x4)
кодирую! одну из канонических аминокислот. Остальные три кодона (из 64) - UAA, UGA и
UAG - не кодируют ни одну из канонических аминокислот. Эти кодоны являются сигналами
остановки (терминации) трансляции и поэтому называются стоп-кодонами, или
терминирующими кодонами. Терминирующими кодоны не всегда однозначно распознают
системой трансляции и поэтому в составе мРНК они нередко дублируются. Первым
(основным) стоп-кодоном обычно является кодон UAA, а не небольшом расстоянии следом
за ним располагается один из других терминирующих триплетов (UGA и UAG). Следует
также учитывать, что при синтезе ряда кодон UGA используется для включения в белок
аминокислотного остатка селеноцистеина.
Поскольку число кодирующих триплетов (61) в три раза больше числа
аминокислотных остатков, обычно присутствующих в белках, генетический код сильно
вырожден, так что многие аминокислоты кодируются двумя и более кодонами. Только две
аминокислоты (Met и Тгр) кодируются единичными кодонами (AUG и UGG
соответственно), поэтому очевидно, встречаются в белках реже других. Вырожденность
генетического кода проявляется в том, что для каждой аминокислоты существует более
одной тРНК, и одна тРНК может взаимодействовать более чем с одним кодоном мРНК. В
трехбуквенном генетическом коде наиболее важны первые две буквы, тогда как третья
буква часто бывает разной. Так, например, глицин кодируется четырьмя синонимическими
кодонами: GCA, GCC, GCG и GCU. В связи с преобладающей ролью первых двух кодонов
(считая с 5' - конца триплета мРНК) генетический код иногда называют квазидуплетным
(псевдодуплетным). Эта особенность кода позволяет использовать меньшее число тРНК:
для взаимодействия с 61 кодонов достаточно 31 тРНК в цитоплазме и всего 22 тРНК в
белоксинтезирующей системе митохондрий животных.
Генетический код почти всегда универсален, т.е. един для всех живущих на Земле
организмов - от бактерий до человека. Небольшие отличия имеются, однако, в генетическом
коде митохондрий и хлоропластов. Нет ни каких данных о том, что когда- либо
существовали организмы с другим кодом или другими аминокислотами. Очевидно,
генетический код тщательно сохраняется в эволюции и изменения в коде, а также
рибосомальном аппарате клеток следует признать сильно заторможенными.
Активация аминокислот
Перед началом трансляции синтезированные в результате разнообразных
биохимических реакций или полученные с пищей протеиногенные аминокислоты должны
пройти стадию активации и присоединиться к тРНК. осуществляющими их доставку к
рибосомам. Во всех клетках имеется набор тРНК, которые служат адапторами при переводе
нуклеотидных последовательностей мРНК в аминокислотные последовательности белков. В
структуре тРНК содержится несколько функционально важным участков (петель), главными
из которых для адаптерной функции являются антикодон и акцептирующий конец.
Антикодон служит для взаимодействия с соответствующим (комплементарным)
кодоном мРНК, а акцептирующий конец (расположенная на 3' - конце молекулы тРНК
последовательность ССА-ООН) – для присоединения аминокислоты. Наличие антикодона и
акцептирующие свойства тРНК позволяют им выполнять адаптерную функцию: связывая и
перенося аминокислотный остаток и присоединяясь за счет антикодона к соответствующему
кодону мРНК, они позволяют аминокислотным остаткам выстраиваться в порядке,
диктуемом последовательностью нуклеотидов в матричной молекуле РНК, и таким образом
способствуют переводу последовательности нуклеотидов в последовательность
аминокислотных остатков синтезируемого белка в соответствии с правилами генетического
кода. Каждая тРНК может переносить только одну из аминокислот, вовлекаемых в
биосинтез белка. Для большей части аминокислот имеется несколько тРНК, которые
называются изоакцепторными и обозначаются соответственно тРНК1Gly, тРНК2Gly '' и т.д.
Существование изоакцепторных тРНК связано с вырожденностью генетического кода. В
результате присоединения аминокислот к 3' - конuy молекулы тРНК аминокислоты
активируются между карбоксильным концом молекулы и концевым аденозином
акцептирующего конца тРНК возникает макроэргическая связь, энергия которой
используется далее для синтеза пептидной связи в ходе биосинтеза белка на рибосомах. В
результате специфического взаимодействия тРНК и соответствующей аминокислоты
возникает аминоацил-тРНК - молекула, содержащая активированный аминокислотный
остаток и соответствующий антикодон и являющаяся истинным субстратом для реакции
синтеза полипептидной цепи белка.
Для каждой из аминокислот существует своя особая аминоацил-тРНК-синтетаза,
которая осуществляет специфическое узнавание и связывание аминокислот и тРНК. в
результате чего и возникает аминоацил-тРНК. Аминоацил-тРНК-синтетазы (АРСазы)
обладают исключительно высокой субстратной специфичностью, активируя только
белковые аминокислоты L-ряда и присоединяя их к имеющей определенный антикодон
тРНК. Таким образом, они как бы сообщают аминокислоте определенный шифров виде трех
нуклеотидов антикодона тРНК и поэтому эти ферменты иногда называют кодазами или
шифразами. Выдающаяся роль АРСаз в безошибочном синтезе полипептидных цепей
белков была доказана в специальных экспериментах с использованием бесклеточных систем
белкового синтеза. В этих опытах осуществляли химическое превращение аминокислотных
остатков в составе аминоацил-тРНК, заменяя например, остаток цистеина на остаток
аланина. При использовании таких молекул в ходе биосинтеза неправильные
аминокислотные остатки (Ala) включались в полипептидную цепь во всех тех положениях,
которые соответствовали антикодонам тРНК (TPHKCys).
АРСазы могут образовывать комплексы (кодосомы), в состав которых входят
несколько АРСаз. а также ферменты, которые в свою очередь регулируют их активность
(протеинкинзы, протеинфосфатазы, метилтрансферазы и др.) путем соответствующих
ковалентных модификаций (фосфорилирование, метилирование и др.).
АРСазы могут присоединять аминокислотные остатки как 3'-, так и 2'- гидроксильным
группам концевого аденозина, расположенного на акцептирующем участке тРНК. Одни из
АРСаз преимущественно связывают аминокислоту с З'-ОН группой рибозы (серил- глицилтРНК-синтетаза), а другие с 2'-ОН-группой (фенилаланил-тРНК-синтетаза). Однако для
биосинтеза белка это не имеет существенного значения, так как аминокислотный остаток
может достаточно легко переходить из одной позиции в другую через образование 2', 3' цикла.
После
образования
аминоацил-тРНК
эти
молекулы
направляются
к
рибосомам рибонуклеопротеиновым частицам, специально приспособленным
к
биосинтезу полипептидных цепей белков.
Рибосомы. Изучение рибосом и механизма белкового синтеза продолжается уже более
полувека, что связано со сложностью их пространственной организации и многоэтапностью
самого процесса трансляции. В дифференцированных клетках эукариот синтез белка идет
преимущественно в эндоплазматической сети и особенно в той ее фракции, которая носит
название гранулированный (шероховатый) эндоплазматический ритикулум. мембраны
которого буквально усеяны многочисленными рибосомами. В клетках бактерий рибосомы
рассредоточены по всей протоплазме, и их число достигает ~10 на одну клетку. Цитоплазма
недифференцированных быстро и растущих эмбриональных клеток эукариот также
содержит преимущественно свободные рибосомы. Определенное число белков
синтезируется также в ядре, в митохондриях и хлоропластах растений. В митохондриях
выявлены рибосомы, которые несколько отличаются от обычных (цитоплазматических)
рибосом по размеру (коэффициенту седиментации), что, вероятно, связано с особенностями
происхождения этих органелл, спецификой их геномов и генетического кода. Так,
митохондриальные рибосомы грибов имеют коэффициент седиментации 75S, а
митохондриальные «минирибосомы» млекопитающих - 55S. Цитоплазматические рибосомы
эукариот и рибосомы прокариот очень сходны по структуре. Каждая их них состоит из двух
субчастиц - большой и малой, комплекс которых и представляет собой собственно рибосому
с молекулярной массой 2,5 млн (70S) у прокариот или 4,2 млн (80S) - у эукариот. Малая
субчастица (30-40S) служит для связывания мРНК и тРНК, а большая участвует в
образовании пептидной связи. Основу (каркас) каждой субчастицы составляют молекулы
рибосомальных РНК, вокруг которых в определенном числе и порядке группируются белки
малой (S-белки) и большой (L-белки) субчастицы рибосомы.
У всех прокариотических форм жизни (эубактерии, актиномицеты, синезеленые
водоросли и архебактерии) присутствуют 70S рибосомы. Весовое соотношение РНК: белок
у них составляет 2:1. Около 2% сухой массы рибосом составляет Mg. В препаратах
рибосом, выделенных из прокариот, обычно присутствуют органические поликатионы,
такие, как спермин, спермидин, кадаверин и путресцин (суммарное количество -2,5%
от сухой массы рибосом).
В цитоплазме эукариот содержатся несколько более крупные 80S рибосомы, у
которых соотношение РНК: белок близко к 1:1. В их составе обнаружены ионы Mg2* и
Са"+, а также небольшое количество полиаминов.
Литература:
1. Уотсон Дж. Молекулярная биология гена. М.: Мир, 1978.
2. Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Высшая школа, 1990.
3. Молекулярная биология: Структура рибосом и биосинтез белка / Под ред. А.С.Спирина.
М.: Высшая школа, 1986.
4. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. М.: Высшая школа,
1996.
Вопросы для самоконтроля:
1. Генетический код.
2. Активация аминокислот
Неделя 6
Кредит час 11
Лекция № 6
Тема: Процесс биосинтеза белка на рибосомах.
Цель: ознакомиться с процессом биосинтеза белка на рибосомах.
Содержание лекции:
Последовательность событий в процессе биосинтеза белков на рибосомах обычно
подразделяют на три больших этапа: инициацию, элонгацию и терминацию.
Процесс прочтения (трансляции) мРНК стартует с определенного его участка, где
начинается кодирующая (транслируемая) последовательность нуклеотидов. Для
обеспечения начала (инициации) трансляции необходим инициирующий (стартовый) кодон
мРНК, инициаторная аминоацил-тРНК и белковые факторы инициации. После инициации
рибосома последовательно транслирует мРНК в направлении ее 3' - конца. Трансляция
сопровождается синтезом полипептидной цепи белка путем последовательного и
присоединения аминокислотных остатков к карбоксильному (С-концу) растущего пептида.
Удлинения (элонгация) пептида происходит в соответствии с последовательностью кодонов
мРНК, прочтение каждого из которых сопровождается присоединением к пептиду одного
аминокислотного остатка, доставляемого соответствующей тРНК. Для обеспечения
элонгации необходимо наличие аминоацил-тРНК. Для обеспечения элонгации является
реакция служит GTP. Центральным моментом элонгации является реакция
транспептидирования - синтез пептидной связи с участием активированных аминокислотных
остатков, доставляемых в рибосому в составе аминоацил-тРНК. С-концевой карбоксильной
группой растущей полипептидной цепи и свободной аминогруппой очередной
аминокислоты, переносимой тРНК. На зротяжении всего процесса карбоксильный коней
полипептида остается в активированной форме, будучи связан макроэргической связью с
тРНК. В каждой реакции синтеза очередной пептидной связи макроэргическая связь
разрывается и тут же замещается такой же связью, образованной следующим
аминокислотным остатком, доставленным аминоацил-тРНК. Терминация трансляции
происходит тогда, когда рибосома достигает терминирующего кодона мРНК. С данным
кодоном " обычно не взаимодействует ни одна из аминоацил-тРНК, вместо этого к мРНК
присоединяются белковые факторы терминации, под действием которых синтезированный
пептид высвобождается из рибосомы. В случае трансляции моноцистроновых мРНК
биосинтез белка на этом заканчивается. При трансляции полицистроновых мРНК рибосома
может продолжить движение, пока не дойдет до очередного инициирующего кодона, с
которого начнется новый полный цикл трансляции, включающий инициацию, элонгацию и
терминацию.
Рибосома в процессе трансляции выполняет ряд функций: связывает и удерживает
мРНК, связывает аминоацил-тРНК, осуществляет синтез пептидной связи, удерживает
растущий полипептид, участвует в гидролизе ОТРи продвигается по мРНК,
взаимодействует с белковым факторами трансляции. Для выполнения всех этих функций
рибосома должна обладать соответствующими функциональными центрами, из которых
только часть в настоящее время четко идентифицирована. Так, мРНК, вероятно, связывается
с 30 S-субчастицей в районе желобка, отделяющего головку от боковой лопасти и головку от
тела. В связывании мРНК у прокариот главную роль играет комплементарное
взаимодействие определенного пурин-богатого участка ее молекулы (последовательность
Шайна - Дальгарно) с коротким пиримидин-богатым участком 3' -конца молекулы 16 Sсубчастице. В связывании и удерживании мРНК, вероятно, участвуют белки малой
субчастицы (S3, S5, S10, S14), а также стержень (палец) большой субчастицы (белковый
комплекс L7/ L12).
Связывание аминоацил-тРНК происходит в рибосоме в двух специальных центрах,
которые формируются в результате объединения большой и малой субчастиц- Р-центре
(пептидальный центр) и A-j центре (аминоацилбный центр). Оба центра достаточно
компактны и расположены рядом друг с другом вблизи головки 30 S-субчастицы. Здесь
происходит взаимодействие акцептирующих концов аминоацил-тРНК и пептидил-тРНК с
образованием пептидной связи (реакция транспептидирования). Для формирования А- и Рцентров, вероятно, необходимо взаимодействие всех рРНК рибосомы, а также целого ряда
белков большой и малой субчастиц.
Связывание разнообразных белковых факторов элонгации и GTP, по всей видимости,
происходит на 50 S-субчастице в районе L7/ L12 - стержня. К связыванию GTP способны
специфические белковые факторы трансляции: EF-Tu, EF-G (факторы элонгации), IF-2
(фактор инициации), RF-2 (фактор терминации). Эти факторы всегда взаимодействуют с
рибосомой в комплексе с GTP, т.е. представляют собой GTP-связывающие белки (G-белки).
При связывании с рибосомой активируется СТРазная активность того или иного из этих
факторов, а высвободившая в результате гидролиза GTP энергия используется на
соответствующих энергоемких стадиях трансляции.
Пептидилтрансферазный центр, в 5S РНК - белковый комплекс котором идет синтез
пептидной связи, локализован в 50S-субчастице и расположен вблизи центрального
протуберанца на вогнутой поверхности, контактирующей с 30S-субчастицей. В организации
этого центра, вероятно, приминают участие один из доменов 23S рРНК и некоторые белки
50S-субчастицы. Многочисленные попытки идентифицировать пептидилтрансферазу среди
белков рибосом не увенчались успехом, и складывается впечатление, что за синтез
пептидной связи ответственна 23S pPHK. Комплекс перемещений (транслокация) молекулы
мРНК. деацилированной тРНК и пептидил-тРНК, осуществляемый по GTP-зависимому
механизму, может, вероятно, происходить в результате взаимодействия субчастиц рибосом
(их размыкания и смыкания) при участии стержня большой субчастицы. Такая динамичная
модель работы рибосом детально разработана академиком А.С. Спириным.
Этапы трансляции
Инициация белкового синтеза состоит из нескольких стадий и обслуживается рядом
белковых факторов инициации (IF-Initiation Factors). У бактерий существуют три таких
фактора: IF-I, IF-2 и IF-3. Фактор IF-2 обладает СТРазную активностью и играет
центральную роль в связывании инициаторной аминоацил-тРНК. Два других фактора,
вероятно, влияют на конформацию ЗОБ-субчастицы, помогая ей связываться с тРНКШм,
переносящей модифицированный остаток метионина - формилметионил. Именно этой тРНК
предстоит связаться с инициирующим кодоном мРНК - кодоном AUG. В некоторых случаях
первой аминокислотный остаток включается не на метиониновом кодоне AUG, а на кодоне
GUG, который кодирует Валин. Это связано с тем, что для эффективной инициации у
прокариот стартовый кодон должен располагаться на вершине шпилечной структуры мРНК,
перед которой на расстоянии от 3 до 10 нуклеотидов должна располагаться пурин-богатая
последовательность Шайна-Дальгарно. Комплементарное спаривание антикодона тРНКfMet с
инициирующим кодоном имеет принципиально важное значение, так как именно это
взаимодействие
определяет
рамку
считывания
(трансляции)
нуклеотидной
последовательности мРНК, которая в принципе может декодироваться с трех различных
позиций (по числу нуклеотидов в кодоне), и в результате могут быть синтезированы три
различные полипептидные цепи.
На следующей стадии инициации происходит присоединение 30S-субчастицы мРНК и
узнавание инициирующего кодона AUG среди других аналогичных кодонов, кодирующих
метионин. Инициаторная тРНКfMet при этом связывается 30S-субчастицей в виде комплекса с
факторами инициации и GTP. Выбор правильной точки инициации на молекуле мРНК
определяется, очевидно, ЗОБ-субчастицей. Выбор старого кодона у бактерий происходит с
участием короткой (от 5 до 8 нуклеотидов) пурин-богатой последовательности ШайнаДальгарно в мРНК, которая комплементарно связывается с пиримидин-богатым участком
вблизи 3' - конца 16S рРНК, локализованной в ЗОБ-субчастице рибосомы. Таким образом,
взаимодействие трех видов РНК (мРНК, 16S рРНК и тРНКfMet) устанавливает рамку
считывания и предопределяет аминокислотную последовательность синтезируемого белка.
После образования комплекса 30S-субчастицы с мРНК и тРНКfMet белковые факторы
инициации IF- 3 и IF-1 покидают 308-субчастицу, уступая место 508-субчастице,
присоединение которой завершает процесс сборки полной (70S) рибосомы прокариот.
Объединение
субчастиц
приводит
к
формированию
двух
центров
связывания тРНК: Р-центра и А-центра, назначение и локализация которых в рибосоме были
отмечены нами ранее. Далее под действием фактора IF-2 происходит гидролиз GTP, а
высвободившаяся при этом энергия, вероятно, расходуется на стабилизацию (закрепление)
тРНКfMet в Р-центре рибосомы. Одновременно формируется А-центр рибосомы,
предназначенный
для
присоединения
следующей
аминоацил-тРНК
и,
таким образом, заканчивается процесс сборки активной (транслирующей) рибосомы,
осуществляющей элонгацию белкового синтеза.
Элонгация трансляции у бактерий обслуживается тремя белковыми факторами (EF-Tu,
EF-Ts и EF-G) и может быть подразделена на три стадии. На первой стадии к А-центру
рибосомы присоединяется аминоацил-тРНК, приносящая второй (после f-Met)
аминокислотный остаток, кодируемый вторым (после триплета AUG ) кодоном мРНК. Таким
образом, создаются условия для образования пептидной связи между аминокислотными
остатками, связанными с соответствующими тРНК закрепленными в А- и Р- центрах
рибосомы. Поступая в А-центр, аминоацил-тРНК закрепляется в нем в комплексе с
белковым фактором EF-Tu и GTP. В связывании аминоацил-тРНК, вероятно, принимают
участие не только антикодоны, но и другие участки, поскольку посттранскрипционные
модификации ее молекулы существенно влияют на связывания с рибосомой. При участии
фактора EF-Tu осуществляется гидролиз GTP до GDP и фосфата, а выделяющая энергия
расходуется на сближение двух акцептирующих концов молекул тРНК с прикрепленными к
ним аминокислотными остатками. Комплекс EF-Tu - GDP при этом покидает рибосому и
регенерируется с участием фактора EF-Ts, так что фактор EF-Tu вновь оказывается
связанным с молекулой GTP, а затем и со следующей молекулой аминоацил-тРНК.
На
следующей
стадии
элонгации
транспептировании
первый
(формилметиониновый) остаток переносится на свободную NH2-rpynny второго
аминокислотного остатка, связанного с тРНК. расположенной в А-центре рибосомы. В
результате этой реакции, химизм которой был разобран выше, образуется первая пептидная
связь в молекуле синтезированного белка и возникает дипептидил-тРНК. Стоящим первым
на N-конце остаток fMet (у эукариот им является остаток Met) впоследствии отщепляется
при участии аминопептидаз. Отщепление метионина существенно потому, что N-концевой
аминокислотный остаток может определять жизни белка, воздействуя на убиквитинзависимый путь его деградации.
Третья стадия элонгации - транслокация - заключается в том, что дипептидил-тРНК,
оставаясь с соответствующим кодоном мРНК, перемещается из А-центра в Р-центр
рибосомы, одновременно с продвижением транслируемой мРНК через рибосому. При этом
освободившаяся от аминокислотного остатка в результате реакции транспептидирования
тРНКfMet удаляется из р-центра, перемещаясь в Е-центр рибосомы, и далее выводится из нее.
Одновременно освобождается А-центр, необходимый для связывания следующей
аминоацил-тРНК. Транслокация, которую можно рассматривать как «шаг» рибосомы по
мРНК в направлении 5'—>3', происходит строго на расстояние, соответствующее размеру
одного триплета в мРНК. В результате транслокации напротив освободившегося А-центра
располагается очередной кодон мРНК. определяющий присоединение соответствующей
аминоацил-тРНК. Транслокация у бактерий идет с участием фактора EF-G и
сопровождается гидролизом еще одной молекулы GTP.
Многократное последовательное воспроизведение всех вышеотмеченных стадий
элонгации обеспечивает удлинение полипептидной цепи в соответствии с кодом белкового
синтеза и происходит с весьма высокой скоростью: в бактериальной клетке
продолжительность одного цикла элонгации составляет -1/20 с, а весь синтез белка
среднего размера (-400 аминокислотных остатков) занимает около 20 с.
Терминация трансляции у бактерий связана с функционированием трех белковых
факторов: RF-1, RF-2 и RF-3 (по англ. recognize - узнавать), распознающих
«бессмысленные» стоп-кодоны в мРНК. Фактор RF-1 узнает кодоны UAG и UAA, а фактор
RF-2 - кодоны UAA и UGA. Фактор RF-3 выполняет вспомогательную роль, стимулируя
работу RF-1 и RF-2. При поступлении в рибосому одного из терминирующих кодонов с ним
немедленно связывается соответствующий RF-фактор и тем самым блокирует
присоединение аминоацил-тРНК. К тому же в клетках обычно отсутствуют тРНК с
антикодонами, комплементарными стоп-кодонам тРНК. Присоединение факторов
терминации стимулирует, пептидилэстеразную активность в рибосоме (она свойственна, в
частности, белками L11и L16), которая приводит к гидролизу сложноэфирной связи между
С-концом синтезированного полипептида и акцептирующим концом тРНК. В результате
синтезированный белок отделяется от рибосомы: одновременно отделяются тРНК и мРНК, а
сама рибосома диссоциирует на 30S-H 50Я-субчастицы. В терминации транскрипции
принимает участие молекула GTP, которая, вероятно, служит аллостерическим регулятором
активности белковых факторов терминации.
Поскольку мРНК бактерий, как правило, полицистроновые (т.е. несут информацию о
структуре нескольких белков), они содержат несколько инициирующих и несколько
терминирующих кодонов. Хотя рибосома бактерий распознает терминирующие кодоны,
она может пройти по мРНК и дальше, начав трансляцию следующего участка в
полицистроновой мРНК. Кроме этого, трансляция может стартовать не с первого, а со
второго или последующего инициирующего кодона, и таким образом на одной мРНК могут
синтезировать разные белки.
В клетках эукариот этапы биосинтеза белка в основном соответствуют таковым у
прокариот, однако представляют собой более тонко организованный процесс,
43က43
трансляции. Как известно, зрелые мРНК эукариот содержат на 5' -конце особую структуру кэп, который, ":ак установлено, необходим для всязывания мРНК с малой (40S) субчастицей
рибосомы. У большинства моноцистроновых мРНК эукариот в качестве стартового
используется ближайший к 5' - концу триплет AUG, и ни один из других триплетов AUG,
расположенных в кодирующей области мРНК, не может быть использован в качестве
инициирующего. Инициация трансляции с кодона AUG происходит только тогда, когда он
находится в составе соответствующего" нуклеотидного окружения: за два нуклеотида до
него должен располагаться пуриновый нуклеотид (А или G). а сразу после него - G:
...NNNA(G)NN | AUG | GNNN....,
где N - пиримидиновый нуклеотид.
Перед началом трансляции у эукариот последовательность мРНК как бы сканируется
(просматривается) начиная с 5' - конца (кэпа) для поиска AUG, расположенного в
вышеотмеченном оптимальном нуклеотидном окружении. Инициация трансляции у
эукариот связана с функционированием большего числа белковых факторов инициации,
которые называются eIFl-elF5. Эти факторы условно подразделяют на две группы. К первой
группе относятся те из них, которые взаимодействуют с субчатицами рибосомы и тем самым
облегчают присоединение инициаторной аминоацил-тРНК (тРНКfMet) и мРНК. Факторы
второй группы участвуют в подготовке 5' - концевой области мРНК к инициация
трансляции. К первой группе принадлежат факторы eIF-1, eIF-2 и eIF-З (аналогии факторов
IF-1 - IF-3 прокариот), а также ряд дополнительных факторов (eIF-2B и eIF-S). Вторая
группа факторов специфична для эукариот и включает мРНК-связывающие и мРНКрасплетающие белки. Важнейшими из них являются факторы из группы eIF-4 (eIF-4A, eIF4B, eIF-4E и efF-4F). Фактор инициации elF -4F представляет собой белковый комплекс,
который связывается с кэпом эукариотической мРНК. Он состоит из трех субъединиц (α,β и
γ), одна из которых (субъединиц β) обладает РНК-зависимой АРТазной активностью.
Активность факторов eIF-4E регулируется путем их фосфорилирования /
дефосфорлирования.
После связывания кэпа для инициации трансляции необходимо расплетание
вторичной структур мРНК в 5' - нетранслируемой области. Эти АТР-зависимый процесс у
эукариот осуществляется за счет РНК-хеликазной активности белковых факторов eIF-4A и
eIF-4B. Фактор eIF-4A существует как в свободном виде (белок с массой 45 кДа), так и в
комплексе с фактором eIF-4F. и именно ему, по-видимому, свойственна АТРазная и РНКхеликазная активность.
В целом большинство белковых факторов инициации эукариот функционируют в виде
крупных белковых комплексов инициации трансляции (коэффициенты седиментации 43S и
48S). Связывание и продвижение этих комплексов по мРНК (вместе с малой субчастицей
рибосомы)
блокируется
особым
белком-репрессером
инициации.
Репрессор
взаимодействует с элементами вторичной структуры (шпильками) мРНК, расположенными
в 5' - нетранслируемом районе мРНК (либо в начале кодирующей области), стабилизирует
соответствующие шпильки и тем самым предотвращает функционирование комплекса
факторов инициации.
В элонгации трансляции у эукариот участвуют два фактора (eEF-1 и eEF-2). которые
являются аналогами факторов EF-Tu, и EF-G бактерий. Фактор eEF-1 образует комплекс с
аминоацил-тРНК и GTP, и этот комплекс присоединяется к А-центру рибосомы. После
предварительного «узнавания» (кодоно-антикодонового взаимодействия) фактор
элонгации расщепляет GTP и отходит от рибосомы вместе с GDP. освобождая тем самым
акцептирующий конец пептидил-тРНК и открывая возможность для удлинения пептида в
последующей реакции транспептидирования. Небольшая пауза между узнаванием и
гидролизом GTP достаточна для отделения от МРНК несущих неправильные (не вполне
комплементарные) антикодоны аминоацил-тРНК. Таким образом этот фактор снижает
вероятность включения несоответствующих аминокислотных остатков в полипептидную
цепь белка. Факторы элонгации эукариот в отличие от соответствующих факторов
прокариот обладают выраженной РНК-связывающей способностью. Эти белки,, как и
аминоацил-тРНК-синтетазы, взаимодействуют с кодирующим участком мРНК, к которому
присоединяется еще ряд ферментов, имеющих специфическое сродство к РНК
(глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, лактатдегидрогеназа и др.). Предполагают, что
эти NAD+/NADH - зависимые ферменты участвуют в энергическом обеспечении
биосинтеза белка, способствуя созданию высокой концентрации АТР и GTP в
белоксинтезирующей системе.
В терминации трансляции эукариот участвует один белковый фактор - R, функция
которого аналогична белковым факторам терминации бактерий.
Литература:
1. Уотсон Дж. Молекулярная биология гена. М.: Мир, 1978.
2. Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Высшая школа, 1990.
3. Молекулярная биология: Структура рибосом и биосинтез белка / Под ред. А.С.Спирина.
М.: Высшая школа, 1986.
4. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. М.: Высшая школа,
1996.
Вопросы для самоконтроля:
Этапы трансляции
Неделя 7
Кредит час 13
Лекция № 7
Тема: Тонкое строение гена.
Цель: ознакомиться с тонким строением гена.
Содержание лекции:
Для клеток эукариот характерно наличие оформленного ядра. Информационной
макромолекулой их генома является ДНК, которая неравномерно распределена по
нескольким хромосомам в виде комплексов с многочисленными белками. Однако
генетическую информацию в клетках содержат не только хромосомы ядра. Жизненно
важная генетическая информация заключена и во внехромосомных молекулах ДНК. У
эукариот - это ДНК хлоропластов, митохондрий и других пластид. Под генном
эукариотического организма в настоящего время понимают суммарную ДНК гаплоидного
набора хромосом и каждого из внехромосомных генетических элементов, содержащуюся
в отдельной клетке зародышевой линии многочисленного организма.
Суммарное количество ДНК в гаплоидном геноме принято обозначать латинским
символом С. Оно: измеряется в пикограммах (пг), может быть выражено в парах
нуклеотидов или дальтонах: 1 пг =0,965-10 н.п. =6,1-10" Да. Размер генома эукариот в
среднем на 2-3 порядка выше, чем у прокариот.
Организм
Средний размер генома, н.п.
Мелкие вирусы
1,0*104
Микоплазмы
Бактерии
Грибы
Насекомые
Моллюски
Костистые рыбы
Бесхвостые амфибии
1,6*106
2,0*106
4,7*107
2,3*108
1,6*109
1,4*109
2,7*109
Хвостатые амфибии
Рептилии
3,6*1010
1,5*109
Птицы
Млекопитающие
1,2*109
2,6*109
Человек
Растения:
Голосеменные
покрытосеменные
лилия (Lillum longiflorum)
1,6*1010
2,7*1010
1,8*1010
Геном эукариот существенно отличается от генома прокариот по ряду признаков,
среди которых необходимо отметить его избыточность. Эукариотическая клетка содержит
во много раз больше генов, чем прокариотическая. Повышенное содержание ДНК в геноме
эукариот нельзя объяснить лишь увеличением потребности этих организмов в
дополнительной генетической информации в связи с усложнением организации, поскольку
большая часть их геномной ДНК, как правило, представлена некодирующая
последовательностями нуклеотидов. Феномен значительной избыточности генома эукариот
в отношении некодирующих последовательностей нуклеотидов известен под названием
«парадокса С».
Получить суммарную характеристику степени разнообразия последовательностей
ДНК, образующих геном, можно исследуя кинетику реассоциации денатурированной ДНК.
Структура эукариотических генов
Организация генов у эукариот значительно сложнее, чем у прокариот. Эукариотический
ген можно рассматривать как совокупность сегментов ДНК, которые вместе составляют
экспрессируемую единицу, ответственную специфического функционального продукта либо молекулы РНК, либо полипептида. К; сегментам ДНК, составляющим ген, относятся
следующие элементы:
1. Единица транскрипции - это участок ДНК, кодирующий первичный транскрипт. Он
включает а) последовательность, которая обнаруживается в зрелых функциональных
молекулах РНК; б) интроны (для мРНК); в) промежуточные последовательности
спейсеры (для рРНК). Интроны и спейсеры удаляются в ходе процессинга первичных
транскриптов; г) 5'- и З'-нетранслируемые последовательности (5'- НТП и 3'- НТП).
2.Минимальные последовательности, необходимые для начала транскрипции (просмотр)
и конца транскрипции (терминатор).
3.Последовательности, регулирующие частоту инициации транскрипции: ответственные
за индуцибельность и репрессию транскрипции, а также клеточную, тканевую и
временную специфичность транскрипции. Они разнообразны по строению, положению
и функциям. К их числу относятся энхансеры (от англ. enhance - усиливать) сайленсеры
(по англ. silence - заглушать) - это последовательности ДНК, расположенные в тысячах
пар нуклеотидов о просмотра эукариотического гена и оказывающие дистанционное
влияние на его транскрипцию. В это определение гена не включены последовательности
ДНК, которые вдияют на пространственную конфигурацию гена в хроматине, ни
последовательности, которые регулируют его топологию.
Гены, кодирующие белки
В отличие от прокариотических генов, почти всегда коллинеарных своим РНК, многие
гены эукариот: имеют мозаичное строение. Под мозаичностью в данном случае
подразумевается чередование кодирующих (экзоны) и некодирующих (вставочные
последовательности, или интроны) последовательностей в пределах единицы транскрипции.
Интроны чаще всегда встречаются в генах, кодирующих белки. За исключением некоторых
генов, кодирующих пять гистонов, α- и β- интерфероны, все гены, кодирующие белки
позвоночных, содержат интроны. У большей части генов Drosophila интроны отсутствуют.
Однако некоторые кластеры генов, регулирующие развитие органов тела насекомого,
содержат множество интронов. Интроны присутствуют и во многих растений.
Размеры, число и местоположение интронов у разных генов различны. Тем не менее,
сходные гены у организмов разных видов часто имеют одинаковое число интронов в одних
и тех же позициях, хотя длина и нуклеотидная последовательность интронов могут заметно
различаться. Обычно число интронов на ген возрастает пропорционально длине
последовательности, кодирующей белок, а размеры экзонов в среднем составляют около 300
н.п. В целом общая длина последовательностей интронов превышает суммарную длину
экзонов обычно 2 до 10 раз, а иногда еще больше.
Интроны располагаются в единицах транскрипции не случайным образом. В белок кодирующих генах они часто находятся между сегментами, которые кодируют отдельные
структурные или функциональное домены белков.
Эволюционное возникновение мозаичной (интрон-экзонной) структуры генов
эукариот, так же как и консервативный характер наследования размеров и взаимного
расположения интронов в генах, не находят в данное время исчерпывающего объяснения изза кажущегося отсутствия фактора давления естественного отбора на последовательности
нуклеотидов без четких биологических функции.
Ген
а-Глобин
Организм
Мышь
Человек
Экзоны
суммарна
я длина,
н.п.463
число
Интроны
суммарная
длина, н.п.
596
2
2
256
265
Альбумин
Человек
Курица
Крыса
417
540
2000
2
2
13
964
3619
12 500
а-Амилаза
Крыса
1600
7
7400
Дигидрофолатрелуктаз Мышь
а
1600
26
40 400
Овальбумин
Курица
1872
7
5758
Фиброин
Тутовый
шелкопряд
18 000
1
970
Фазеолин
Фасоль
1263
5
515
Инсулин
Наибольшее рас46က46странение получила концепция В. Гилберта (1977), согласно
которой появление интронов, по-видимому, совпавшее по времени с эволюционным
возникновением многоклеточных организмов, обеспечило возможность обмена экзонами
между непосредственными генами. Такой обмен должен сопровождаться образованием
новых белков мозаичного строения, составленных из готовых. полипептидных
функционально значимых модулей (доменов), ранее принадлежавшим другим белкам
(гипотеза о перетасовке экзонов в процессе эволюции). Следствием этого, по мнению
сторонников данной концепции, были резкое ускорение образования белков и ферментов с
новыми функциями, а также глубокие эволюционные преобразования самих организмов,
реализующих такие молекулярные механизмы. Эта точка зрения получила еще название
«гипотезы позднего возникновения интронов». В соответствии с другой гипотезой (Дж.
Дарнелл и В Дулитл, 1978) современные интроны представляют собой «эволюционные
реликты». Когда-то интроны были частью гигантских генов. Предполагается, что мозаичная
структура генов определяет эволюционные возможности генома, тогда как прокариоты,
утерявшие интроны, представляют собой эволюционный тупик.
Определение нуклеотидных последовательностей в составе гомологичных генов
(например, генов глобулинов) показало, что наибольшим измерениям в эволюции
подвергались интроны, а не экзоны. В интронах обнаружены вставки, делеции и другие
перестройки, в то время как последовательности экзонов оказываются значительно более
консервативными: в них имеются лишь отдельные нуклеотидные замены. Эта наблюдения
можно истолковать в пользу представлений о том, что перекомбинация экзонов
осуществлялась по районам интронов. что¥и сопровождалось изменением их структуры.
Для эукариот характерны моноцистронные единицы транскрипции в отличие от
прокариот, у которых обычно гены организованы в опероны, а их экспрессия
опосредуется полицистронными мРНК. В эукариотических клетках образуются мРНК,
кодирующие только один белок. Даже если ген кодирует не один вид мРНК, как при
альтернативном
сплайсинге,
каждая
зрелая
мРНК
имеет
только
одну;
транслируемую кодирующую последовательность.
Литература:
1. Молекулярная биология. Учебное пособие для студентов медицинских вузов Автор:
Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Изд-во: Медицинское информационное агентство,
2007. С. 536
2. Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Академия, 2011.
3. Бокуть С.В., Герасимович Н.В., Милютин А.А. Название: Молекулярная биология,
изд-во:Вышэйшая школа, Год: 2005
Вопросы для самоконтроля:
1. Гены, кодирующие белки
2. Структура эукариотических генов
Неделя 8
Кредит час 15
Лекция № 8
Цель: ознакомиться со структурой генома вирусов и фагов.
Тема: Структура генома вирусов и фагов.
Содержание лекции:
ГЕНОМ ПРОКАРИОТ
Основной чертой молекулярной организации прокариот является отсутствие в их
клетках ядра, отгороженного ядерной мембраной от цитоплазмы. Отсутствие ядра является
лишь внешним проявлением особой организации генома у прокариот.
Геном прокариот построен очень компактно. Количество некодирующих
последовательностей нуклеотидов минимально. Многие механизмы регуляции экспрессии
генов, использующиеся у эукариот, никогда не встречаются у прокариот. Простота строения
генома прокариот объясняется их упрощенным жизненным циклом.
Структура бактериальной хромосомы
Пятьдесят лет назад все хромосомы прокариот считались линейным. Но в 1956 г Ф.
Жакоб и Е. Вильман предложили кольцевую модель бактериальной хромосомы. С тех пор
эта модель считалась общепринятой по появления метода прямого анализа физической
структуры хромосом - электрофореза в пульсирующем поле. В 1989 г впервые этим
методом была идентифицирована линейная бактериальная хромосома у возбудителя
клещевого спирохетоза Borrelia burgdorferi. Вскоре было обнаружено, что линейная и
кольцевая хромосомы сосуществуют одновременно у Agrobacterium tumefaciens, а у
грамположительных бактерий рода Streptomyces, обладающих одним из самых больших
бактериальных геномов (-8000 тыс.н.п.), имеется одна линейная хромосома. Линейная
Размер генома у различных бактерий колеблется от 580 тыс. н.п. у Micoplasma
genitakium до 9500 тыс. н.п. у Myxococcus xanthus. Для кишечной палочки Е. coli размер
генома составляет 4600 тыс. н.п. (молекулярная масса около 3109 Да, длина молекулы около
1,5 мм). В бактериальных клетках хромосома сильно компактизована. Так, кольцевая
молекула ДНК Е. coli длиной -1,5 мм заключена в клетку, имеющую форму палочки
диаметром 1 мкм и длиной 2 мкм.
Состав сложных геномов бактерий
Бактерии
Геном
Bacillus cereus F0836 76
1 линейная хромосома; 1 кольцевая хромосома; 2
плазмиды
1 кольцевая хромосома; 1 мегаплазмида
Brucella melitensis
2 кольцевые хромосомы
Leptospira interrogans
1 кольцевая хромосома; 1 мегаплазмида
Rhizobium meliloti
1 кольцевая хромосома; 2 мегаплазмиды
Rhodobacter sphaeroides
2 кольцевые хромосомы
Rhodococcus fasians
1 линейная хромосома; линейная плазмида
Streptomyces ambofaciens
1 линейная хромосома
Agrobacterium tumefaciens C58
В последние годы наблюдается прогресс в исследовании первичной структуры
бактериальных хромосом. На конец 2001 г. была определена полная нуклеотидная
последовательность -100 прокариотических геномов.
Размеры и характеристики некоторых прокариотических геномов с известной
нуклеотидной последовательностью приведены в таблице.
Структуры, связанные с репликацией. Полная нуклеотидная последовательность
бактериальной хромосомы позволяет определить структуры генома, связанные с его
функционированием, т.е. с процессами репликации, транскрипции, регуляции и т.д.
Репликация бактериальной хромосомы начинается в точке ori С (origine) и продолжается
в обоих направлениях до участка терминации репликации ter С (terminus). У большинства
бактерий участки ori С и ter С делят кольцевую хромосому на две почти равные реплихоры.
Область начала репликации во многих бактериальных геномах имеет консервативную
структуру.
Подобные
структуры
найдены
почти
во
всех
секвенированных бактериальных геномах.. Для линейных хромосом точка ori С определяется
ровно посередине ее. Направление транскрипции большинства генов бактерий с высокой
скоростью роста совпадает с направлением репликации. Структура области инициации
репликации ДНК архебактерий неизвестна. Отсутствие асимметрии GC в геноме архей
указывает
на
наличие
множественных
участков
инициации репликации.
Открытые рамки считывания и определение функций белка. Открытая рамка
считывания (англ. open reading frame, ORF) состоит из ряда триплетов, кодирующих
аминокислоты; не содержит каких-либо терминирующих кодонов; потенциально может
транслировать в белок.
Характеристики некоторых бактериальных геномов, определенные по их нуклеотиднои последовательности
Видовое название
Mycoplasma genitalium
Размер
Кодирующие Количество ORF Идентифицирова
Характеристика
генома, последовательнос (предположительн но генов
тыс. н.п. ти
ое
число
%
число
генов)
580
89.7
479
324
69 Вызывает воспаления мочеполовых путей
Mycoplasma pheumoniae
817
88.7
677
333
49
Возбудитель пневмонии
В or r el i a burgdoferii
1300
93.0
863
499
58
Helicobacter pylory
1700
91.0
1590
907
57
Возбудитель клещевого спирохетоза
(болезнь Лайма)
Вызывает язвенную болезнь, гастрит
Methanococcus jannaschii
1700
1692
776
46
Анаэроб, метаноген, Т„итроста=85°С
Haemophilus influenzae
1800
1740
1015
58
Вызывает отиты, ОРЗ, менингиты
Synechocystis sp.
3600
87.0
3168
1402
48
Фотосинтезирующая цианобактерия
Bacillus subtilis
4200
87.0
4000
2320
58
Автотроф
Mycobacterium tuberculosis
4400
91.0
3924
-1600
40
Возбудитель туберкулеза
Escherichia coli K-12
4600
88.6
4288
2656
62
Прототрофная энтеробактерия
В установленной нуклеотидной последовательности генома прокариот с помощью
компьютерных программ выявлены открытые рамки считывания. Средний размер их в
прокариотических геномах соответствует примерно 300 аминокислотным остатками.
Сопоставление состава ORF по функциям (также с помощью компьютерных программ)
позволяет идентифицировать компоненты генома, общие для организмов, общие для данной
группы видов и уникальные, специфичные только для данного организма. Функциональная
классификация генов и выявления сходства и различия их метаболизма. В качестве,
модельного объекта использован геном Е. coli. Все белки и кодирующие их гены
классифицированы на три-функциональные группы: энергообмен, информация,
коммуникация (внутри- и внеклеточная). Распределение функций генов Е. coli выявленных
по полной нуклеотидной последовательности генома. Среди 4288 ORF E. coli не выявленных
функции у 40% ORF. Примерно такая же часть генов с неизвестной функцией отмечена и в
других прокариотических геномах.
Минимальный размер генома прокариот. На основании анализа первичной
структуры прокариотических геномов был составлен перечень генов, абсолютно
необходимых для существования свободно живущих клеток. Этот перечень генов получил
название минимальный набор генов. Он кодирует 256 белков и включает следующие
жизненно важные генетические системы микроорганизмов: почти полный набор генов
системы репликации; гены аппарата транскрипции, в которой почти полностью
отсутствуют гены регуляции транскрипции; большой набор генов, кодирующих белки,
гомологичные шаперонам; гены, контролирующие анаэробный метаболизм, включая гены
гликолиза и фосфорилирования субстратов; гены биосинтеза липидов; гены системы
транспорта белков; ген, кодирующие ферменты, использующие сложные кофакторы; набор
генов, обеспечивающий транспорт метаболитов; полный набор генов утилизации
нуклеотидов de novo и гены их биосинтеза.
Функции белков, соответствующих минимальному набору из 256 генов
Функция
Преобразование энергии
Транспорт и метаболизм аминокислот
Транспорт и метаболизм нуклеотидов
Транспорт и метаболизм углеводов
Метаболизм кофакторов
Метаболизм липидов
Трансляция и биогенез рибосом
Репликация,транскрипция, рекомбинация,репарация
Структурная функция (белки наружной мембраны)
Секреция и адгезия
Шапероны
Транспорт неорганических функция
Предсказана гипотетическая функция
Функция неизвестна
Число белков
28
11
20
5
8
6
6
35
7
5
13
4
15
4
Если же генома прокариотического организма вычесть консервативный минимальный
набор генов для микроорганизмов, живущих в сходной среде, то можно получить те гены,
которые определяют специфические фенотипические характеристики, составляющие
уникальность организма.
Экологическая специфичность на уровне генома. Адаптация к определенным
условиям обитания проявляется как в изменении общих характеристик генома (ГЦ-состав,
суперспирализация ДНК), так и в начале генов, продукты которых обеспечивают
приспособление микроорганизма к тем или иным условиям. Показателен в этом отношении
геном хеликобактерии, обитающей в желудке человека и вызывающей язвенную болезнь.
Хеликобактерии способны к обитанию в кислой среде, так как устанавливают
положительный внутримембранный потенциал при низких рН и модифицируют
микросреду с помощью уреазы. Белки Н. pylori содержат двое больше основных
аминокислотных остатков аргинина и лизина, чем белки Е. coli. С паразитизмом связано
наличие у Н. pylori не менее пяти различных систем адшезии для прикрепления к
эпителиальным клеткам желудка. Неожиданным является наличие в геноме Н. pylori 14
генов (более 1% генома), относящихся к системе рестрикции - модификации типа II.
Вероятно, эта система, кроме расщепления чужеродной ДНК, имеет иную, неизвестную
пока биологическую функцию.
Отсутствие определенных генов также указывает на особенности метаболизма,
связанные с условиями жизни микроба. Если организм обеспечен ресурсами за счет их
адсорбции, то механизмы синтеза (а значит, и гены) могут исчезнуть.
Литература:
1. Уотсон Дж. Молекулярная биология гена. М.: Мир, 1978.
2. Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Высшая школа, 1990.
3. Молекулярная биология: Структура рибосом и биосинтез белка / Под ред.
А.С.Спирина. М.: Высшая школа, 1986.
4. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. М.: Высшая
школа, 1996.
Вопросы для самоконтроля:
Экологическая специфичность на уровне генома.
Минимальный размер генома прокариот.
Структуры, связанные с репликацией.
Структура бактериальной хромосомы
Неделя 9
Кредит час 17
Лекция № 9
Тема: Молекулярные основы мутаций.
Цель: ознакомиться с концентрацией мутаций, частотой мутирования и причинами мутаций.
Содержание лекции:
Одним из фундаментальных требований, предъявляемых к структуре, которая
выполняет роль постоянного хранилища информации, является ее чрезвычайная
стабильность. Эта стабильность существенна, по крайней мере, в смысле тех характеристик
структуры, которые обеспечивают кодирование генетической информации. Поэтому
необходимым свойством структуры ДНК является высокая стабильность содержания в ней
азотистых оснований и их состав и последовательность в молекулах ДНК не полностью
ограждены от постепенных изменений. Обычно такие изменения происходят не часто и
затрагивают всего несколько оснований. Различные химические и физические факторы
могут модифицировать структуру определенных оснований или даже разрушать
фосфодиэфирные связи, проводя, тем самым, к разрывам цепей. Ошибки также могут
возникать в процессе репликации или рекомбинации, вызывая встраивание одного или
нескольких дополнительных оснований в новую цепь. Вместе с тем почти в любом случае
необходимо осуществление нескольких циклов репликации для того, чтобы появившаяся
модификация могла привести к необратимому изменению в ДНК. Другими словами, ДНКполимераза должна использовать в качестве матрицы изначально поврежденную
полинуклеотидную цепь для того, чтобы исходные изменения стали постоянными.
Необратимые изменения в структуре ДНК получили название мутаций.
Открытие генетической роли ДНК естественным образом породило представление о
том, что мутации возникают в результате изменений в последовательности нуклеотидов.
Некоторые мутации возникают в результате нормальных, обычных процессов в клетке
или при взаимодействии нуклеинового материала с окружающей средой. Такие мутации
называют самопроизвольными или спонтанными мутациями: они появляются с
определенной частотой у любого организма.
Однако частоту мутаций можно существенно увеличить, воздействуя определенными
соединениями. Наследственные изменения, возникающие под действием таких соединений
называют индуцированными мутациями, а сами соединения - мутагенами. Большинство
мутагенов действует прямо, реагируя либо с определенными азотистыми основаниями, либо
встраиваясь в нуклеиновую кислоту.
В процессе мутагенеза любая пара оснований может мутировать. Изменения, которые
затрагивают только одну пару оснований, называют точечными мутациями. Точечные
мутации могут быть двух типов. К первому типу мутаций относят замены одного пурина на
другой пурин или одного пиримидина на другой пиримидин и называют такие мутации
транзициями. Примером трансзиции может служить замена пары C-G на Т-А, или наоборот.
Это наиболее часто встречающийся тип точечных мутаций. Ко второму типу точечных
мутаций относят трансверсии, которые характеризуются заменами пурина пиримидином, и
наоборот, т.е. пара А-Т превращается в Т-А или C-G.
Одной из возможных причин точечных мутаций, относящихся к транзициям, является
химическое превращение одного основания в другое.,Примером может служить
превращение цитозина (Cyt) в уранил (Ura) либо спонтанное, в ходе обычной реакции
окислительного дезаминирования Cyt, либо под действием, например, азотистой кислоты
(HN02). После дезаминирования Суг,в последующем цикле репликации образовавшийся Ura
спаривается с аденином (Ade) в место гуанина (Qua), с которым спаривался бы исходный
Cyt. Таким образом, пара G-C замещается парой А-Т, что совершенно понятно, так как в
последующем цикле репликации в пару с Ade становится Тимин (Thy). В свою очередь, при
действии азотистой кислоты может также происходить дезаминирование Ade. вызывая
обратную транзицию А-Т в G-С.
Другой возможной причиной транзиций может быть ошибочное спаривание оснований,
приводящее к образованию неканонических пар и, следовательно, к искажению двойной
спирали ДНК. При обычной репликации такая ошибка может случайно произойти
вследствие включения неправильного основания, представляющего собой редкую
таутомерную форму. В этом случае спонтанная частота ошибок определяется прежде всего
степенью
точности
функционирования
ДНК-полимеразы.
Существует
также
«репаративный» синтез ДНК, который активируется в результате генетической
рекомбинации или возникших повреждений ДНК. Различные системы репарации также
характеризуются разной частотой ошибок и, таким образом, могут даже увеличивать
частоту наследуемых изменений в последовательности ДНК.
Некоторые соединения которые может отнести к мутагенам, представляют собой
аналоги обычных природных оснований, но эти аналоги способны к неканоническому
спариванию. В процессе репликации они могут включаться в ДНК. Из-за ошибочного
спаривания при их включении или при последующей репликации они могут вызвать целую
серию транзиций. Примером такого мутагена может служить 5-бромурацил (5-Br-Ura). Это
соединение включается в ДНК вместо тимина, но из-за того, что 5-Br-Ura достаточно
эффективно спаривается также с гуанином (вместо аденина), его присутствие ведет к
образованию замен пар А-Т на G-C. В каждом цикле репликации эти замены возникают с
определенной вероятностью, поэтому 5-Br-Ura, однажды включенный в ДНК вместо тимина,
продолжает индуцировать транзиций в последующих циклах репликации.
К следующему классу мутагенов относятся акридиновые соединения. Их связывание с
ДНК настолько деформирует двойной спираль, что это приводит к вставкам (инверсиям)
дополнительных оснований или выпадениям (делециям) оснований при репликации. В
результате каждого мутагенного акта, индуцированного акридином, исчезают или
добавляются одна или несколько пар оснований. Мутации такого типа называют мутациями
со сдвигом рамки считывания.
Долгое время считали, что основным типом мутаций в индивидуальных генах
являются точечные мутации. Однако в настоящее время известно, что по крайней мере, у
бактерий очень часто происходят вставки (инсерции) дополнительного материала или
выпадение (делеции) части или целой вставки, а иногда и соседних с вставками участков
ДНК. Источником этих вставок служат подвижные генетические элементы - определенные
последовательности ДНК, которые способы перемещаться из одного места хромосомы в
другое. Следует иметь в виду, что вставки-и делеции могут возникать (хотя и с меньшей
вероятностью) и по другим причинам - например, в результате ошибок во время
репликации или рекомбинации.
Многочисленные генетические и биохимические исследования показали, что
возникающие мутации локализуются вовсе не равномерно по всему геному. В некоторых
сайтах происходит гораздо больше, мутаций, чем следует ожидать при их случайной
распределении. Их количество в определенных сайтах-может быть в 10 и даже 100 раз
больше случайного статистического возникновения. Такие сайты называют горячи точками.
Долгое время природа горячих точек была неясна. Считали, что горячие точки должны
соответствовать каким-то последовательностям, особенно чувствительным к спонтанными
и индуцированным мутациям. Действительно, было обнаружено, что сайты одних типов
оказывались горячими точками для спонтанных мутаций и мутаций, индуцированных
одними мутагенами, тогда как другие мутации возникали в результате действия других
мутагенов.
Главной причиной спонтанных точечных мутаций у E.coli является присутствие
необычных модифицированных оснований, которые получили название минорных
компонентов ДНК. Свое название модифицированные они получили вследствие того, что
эти основания образуются посредством химической или ферментативной модификации
одного из четырех обычных оснований, присутствующих в норме в ДНК. Однако в
модифицированной форме, под действием ферментов репликации или репарации они в ДНК
не включаются. Среди таких модифицированных оснований, которые появляются в ДНК
уже после репликации, наиболее известны 5-метилцитозин (5-Me-Cyt), 7-метилгуанин (7Me-Gua) и 6-Ы-метиладенин (N -Me-Ade). Наиболее распространеннее модифицированное
основание в составе ДНК это 5-метилцитозин, который находят у про- и эукариот и о котором
уже упоминалось при описании структуры Z-формы ДНК. Модификацию осуществляют
фермент метилаза, который добавляет метальную группу к цитозину только в определенных
участках ДНК, модифицируя лишь незначительную часть всех остатков; цитозина.
В одной наиболее детально исследованном гене (ген lac I, который входит в состав
/аооперона) все горячие точки спонтанных, а также индуцированных точечных мутаций
попадают в сайты, которые у дикого типа содержат 5-метилцитозин. Во всех случаях
мутации возникли в результате транзиции G-C в А-Т. Более того, в штаммах E.coli с
нарушенными процессами метилирования горячие точки обнаружены не были.
Причина таких замен заключается в том, что при спонтанном или индуцированном
дезаминировании 5-Me-Cyt образуется Thy, а это, в свою очередь, приводит к ошибочному
спариванию G с Т, что при последующей репликации может вызывать появление транзиции
G-C—>А-Т.
В данном контексте уместно привести существующее предположение относительного
того, почему в ДНК используется азотистое основание Thy вместо Lira, который, как
известно, является обычным основанием для молекул РНК. Если в результате
окислительного дезаминирования Cyt в ДНК появляется Ura, он воспринимается как
ненормальное для дезоксирибонуклеиновой кислоты основание и поэтому удаляется под
действием репарирующего фермента урацил-ДНК-гликозилазы. В результате в
соответствующем сайте остается неспаренный остаток гуанина, и система репарации по
правилам комплементарное™ включает в поврежденный участок ДНК утраченный цитозин.
Если бы в ДНК присутствовал в качестве обычного нормального основания Ura, то в случае
дезаминирования Cyt ферментные системы не могли бы распознать какой из остатков Ura
является правильным, а какой появился в результате дезаминировании 5-метилцитозина
образуется Тимин, который является обычным компонентом ДНК. Поэтому в таких случаях
система репарации не всегда оказывается способной узнавать ошибку, что приводит к
появлению мутации.
Другой важной известной горячей точкой в гене lac I является последовательность
CTGG, которая повторяется три раза подряд. Мутации возникают в результате делеции или
вставки одной четырехбуквенной единицы. Такие мутации могут появляться в результате
«проскальзывания» при репликации, если одна цепь не точно совпадает с другой.
Например, первая четырехбуквенная единица одной цепи может спариваться со второй
четырехбуквенной единицей другой цепи. В этом случае может произойти добавление или
потеря четырехбуквенных единиц.
Некоторые мобильные генетические элементы имеют предпочтительные участки
включения, играющие роль горячих точек мутаций. Такие участки различаются для разных
подвижных элементов, хотя большинство мобильных элементов включается в ДНК
случайным образом.
Частота мутивирования
Спонтанные мутации, инактивирующие функцию гена, возникают у бактерий 10 -10 ,
т.е. один раз за время одной репликации в расчете на один локус.
Точных данных относительно скорости мутивирования в случае эукариот в настоящее
время нет. Однако обычно считают, что она примерно совпадает с таковой у бактерий.
Неизвестно также, какая доля спонтанных мутаций у бактерий обусловлена точечными
мутациями, а какая - включениями мобильных элементов. Ясно только, что оба процесса
играют в мутивировании важную роль.
В случае бактериальных генов, содержащих 1000 пар оснований каждый, частота
мутивирования соответствует изменению одного нуклео?ида из 109-1010 нуклеотидов в
расчете на одно поколение. Если говорить только о точечных мутациях, такой подсчет
является сильным упрощением ситуации, поскольку не все мутации приводят к
регистрируемому изменению фенотипа.
Мутации, не приводящие к заметным изменениям фенотипа, называют молчащими
мутациями. Молчащие мутации могут быть двух типов:
1) в первом случае замена одного основания на другое не приводит к замене аминокислоты
в белке (более подробно реализация такой возможности рассмотрена в главе,
описывающей биосинтез белка. В частности, вырожденность кода и реализация
неоднозначенного соответствия позволяют в процессе мутивирования сохранить
аминокислотный состав белка);
2) во втором случае замена основания в ДНК вызывает замену соответствующей
аминокислоты в белке, но эта замена аминокислоты не влияет на функциональные
свойства белка. Молчащие мутации второго типа называют нейтральными мутациями.
Мутации, инактивирующие ген и, следовательно, приводящие к изменению функции
белка - эта прямые мутации. Повреждения, вызванные прямыми мутациями, могут быть
устранены в результате обратных мутаций, которые также подразделяются на два типа:
1) точное восстановление исходной структуры ДНК называют истинной обратной
мутацией (истинная реверсия). Например, если пара А-Т заменяется парой G-C, другая
мутация, восстановившая пару А-Т. восстановит и аминокислотную последовательность
дикого типа в белке;
2) с другой стороны, эффект мутации в одном месте гена может быть компенсирован
мутацией в другом месте этого же гена (вторичная реверсия).
Частота обратных мутаций существенно ниже, чем прямых и обычно составляет
величину в 10 раз меньшую.
Иногда мутации, возникающие в определенных генах, помогают каким-то образом
обойти или. нейтрализовать эффект первой мутации, появившейся в другом гене. Таким
образом, как можно видеть, существует еще один тип мутаций, называемых супрессорными
мутациями, когда повреждающий эффект мутации в одном гене компенсируется мутацией в
другом гене.
Кроме того, необходимо указывать на существование мутаций, которые называют
условно-летальными мутациями. Эти мутации, будучи летальными в одним условиях, либо
совсем не влияют на жизнеспособность клетки, либо оказывают более слабое действия в
других условиях, обеспечивающих продолжение жизни клетки. Все зависит от конкретных
условий, в которых оказалась клетка. При выращивании бактериальных клеток с такими
мутациями в пермессивных условиях мутантный фенотип не проявляется. При
выращивании клеток в непермессивных условиях мутация становиться летальной или
клетка становиться совершенно «больной». Тем не менее, если гибель таких клеток с
условно-летальными мутациями наступает не сразу, эти клетки можно исследовать, а
значит, попытаться установить природу возникновения мутаций данного типа.
Литература:
1. Молекулярная биология. Учебное пособие для студентов медицинских вузов Автор:
Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Изд-во: Медицинское информационное агентство,
2007. С. 536
2. Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Академия, 2011.
3. Бокуть С.В., Герасимович Н.В., Милютин А.А. Название: Молекулярная биология,
изд-во:Вышэйшая школа, Год: 2005
Вопросы для самоконтроля:
Частота мутивирования
Неделя 10
Кредит час 19
Лекция № 10
Тема: Системы защиты ДНК у прокариот.
Цель: ознакомиться с Ферментами модифицирующие структуру ДНК (репарация). Системы
модификации и рестрикции.
Содержание лекции:
Молекулы ДНК осуществляют свои наследственные функции посредством репликации
и транскрипции. В каждом из этих процессов участвует большое количество ферментов и
белковых факторов, среди которых обязательно присутствие соответствующих ДНК- и РНКполимераз. Кроме того, с молекулами ДНК взаимодействуют многочисленные ферменты,
которые модифицируют ее структуру или. репарируют (исправляют) возникающие в ней
повреждения. Рассмотрение этих процессов очень важно с точки зрения проблемы
сохранения целостности структуру ДНК в течение многочисленных поколений, поскольку
сам по себе акт репликации, как бы точно он не функционировал, еще не гарантирует
выполнение роли ДНК в ходе эволюции.
Как про-, так и эукариоты содержат ферменты, метилирующие ДНК, В каждом
бактериальном штампе присутствует один или несколько ферментов, которые
катализируют характерные реакции, определяющие уникальный тип модификации их
собственной ДНК. Именно поэтому бактерия способна отличить свою ДНК от любой
вторгающейся «чужеродной» ДНК по типу ее модификации. Различия в характере
модификации делают чужеродную ДНК чувствительной к действию бактериальных
рестриктирующих ферментов, которые узнают отсутствие специфической модификации
(метилирования) в определенных местах дезоксирибонуклеиновой кислоты и разрезают эту
ДНК.
Системы модификации и рестрикции широко распространены у бактерий, и их
существование играет важную роль в защите своей собственной ДНК от загрязнения
«чужыми последовательностями».
Метилирование ДНК у эукариот также имеет место, но преследует другую цель: в
частности, степень метилирования определенных сайтов определяет степень
функциональной активности тех или иных генов и метильная модификация не связана с
рестрикцией немодифицированных сайтов.
Бактерии имеют несколько систем, защищающих ее ДНК от возможных повреждений,
вызываемых действием внешних химических и физических факторов или ошибками
репликации. Любое появляющееся; отклоне55က55 от правильной двухцепочечной
структуры ДНК узнается соответствующими реиарирующими ферментными системами и
исправляется. Изменения в структуре ДНК могут быть обусловлены точечными мутациями,
делетированием при вставки которых последовательностей, структурными изменениями,
модифицирующими ДНК или связыванием двух оснований с образованием
циклобутиловых (пиримидиновых) диамеров.
Сайты мутаций узнаются специальными нуклеазами, которые вырезают поврежденные
участки, ДНК-полимеразы синтезируют удаленные фрагменты и бреши соединяются
лигазами. Все эти ферментные активности составляют основную репарирующую систему.
Кроме того, существуют системы, исправляющие ошибки репликации. Впервые эти
системы были обнаружены и описаны у мутантных штаммов E.cali. Оказалось, что такие
системы существуют в норме и предназначены для исправления ошибок репликации, не
улавливаемых корректирующей (3'—->5')-экзонуклеазной активностью ДНК-полимераз.
Эта система коррекции неправильного спаривания (mismatch proofreading system),
называемая также системой исправления ошибок спаривания (mismatch repair system),
отличается от других систем репарации ДНК тем, что она не зависит от присутствия в ДНК
аномальных нуклеотидов (например, продуктов дезаминирования оснований, -.включения
аналогов природных нуклеотидов, алкилированных производных или пиримидиновых
димеров), которые должны быть распознаны и удалены с помощью ферментов репарации.
Она выявляет деформации, возникающие на внешней стороне двойной спирали, которые
появляются в результате плохой пригонки обычных, но не комплементарных оснований.
Если бы, эта корректирующая система просто узнавала ошибки спаривания в
реплицированной ДНК и удаляла без разбора один из двух неправильно спарившихся
нуклеотидов, то в половине случаев она сама делала бы ошибки, «исправляя» не вновь
синтезированную дочернюю цепь, а исходную материнскую цепь, так что в среднем частота
ошибок оставалась бы прежней. Очевидно, что для эффективной коррекции система должна
уметь различать неправильно спаренные нуклеотиды, с одной стороны, и избирательно
удалять такие нуклеотиды только из дочерней цепи, с другой стороны, тем самым устраняя
именно ошибки репликации.
В клетках E.coli. процесс узнавания связан с метилированием определенных остатков
аденина в молекуле ДНК. Метальные группы присоединяются ко всем остатком аденина в
исходной и дочерней цепей, входящих в состав последовательностей GATC, но метальные
группы вводятся по остатком аденина дочерней цепей не сразу, а спустя определенное
время после включения в нее аденина. Таким образом, новые дочерние цепи отличаются от
старых материнских тем, что только в них сразу за репликативной Машиной могут
находиться еще не метилированные последовательности GATC. Исправление
неправильного спаривания осуществляется крупным мультиферменным комплексом,
сканирующим каждую из двух цепей двойной спирали позади репликативной вилки. Этот
комплекс удаляет неправильно присоединенные нуклеотиды, но делает это только после
того, как на новой цепи обнаружится неметилированная последовательность GATC.
Именно поэтому ошибочные нуклеотиды удаляются только из дочерней цепи, приводя к
устранению ошибок репликации.
Процессы рестрикции и модификации
Все рестрикционные эндонуклеоазы бактерий узнают специфические, короткие
последовательности; в молекуле ДНК и связываются с ними. Процесс связывания
рестриктаз с ДНК сопровождается ее разрезанием либо в точке связывания рестриктазы,
либо в каком-то другом месте, которое зависит от типа рестриктазы.
Наряду с рестрикционной активностью бактериальные штампы обладают
способностью модифицировать ДНК посредством метилирования. Метилирование
осуществляется так же специфично, как и узнавание мест связывания рестриктаз.
Метилазы добавляют Метальные группы к остаткам Ade или Cyt в том же сайте, в котором
связывается соответствующая рестриктаза. В результате метилирования сайт становится
устойчивым к рестрикции. Следовательно, метилирование защищает ДНК от разрезания.
Таким образом, уникальный способ метилирования препятствует деградации своей
собственной ДНК под действием своих рестриктаз, однако этот способ защиты не
распространяется на «чужую» ДНК. «Чужеродная» ДНК не имеет модифицированных
метальными группами сайтов-мишеней и поэтому атакуется бактериальными ферментами
рестрикции, что приводит к разрезанию такой «чужеродной» ДНК в соответствующих
сайтах с последующей полной деградацией.
Системы модификации и рестрикции были открыты благодаря их действию на
инфицирующую фаговую ДНК. Фаговая ДНК, имеющая одинаковый с клеткой-хозяином
тип модификации, может успешно инфицировать другую бактериальную клетку того же
штамма, так как обе клетки имеют одну и ту же систему модификации. Однако, если эта
фаговая ДНК попадает в клетку другого штамма, она будет; расщеплена рестриктазами.
Следовательно, фаг ограничен (restricted) одним бактериальным штаммом, отсюда и
появился термин рестрикция. Следует, однако, отметить, что рестрикция «чужеродной» ДНК
не всегда неизбежно происходит. Некоторые инфицирующие фаги избегают расщепления их
ДНК, что обусловлено либо мутациями в сайтах-мишенях рестрикции, либо недостаточно
точным срабатыванием системы рестрикции клетки-хозяина. В таких случаях ДНК фага
приобретает тип модификации нового хозяина.
Рассмотрим основные классы рестриктируюших эндонуклеаз и механизм их действия.
Рестрикционные ферменты разделяются на два класса по механизму действия. В свою
очередь, в пределах двух классов рестриктазы подразделяются на более мелкие группы рестриктазы типа I, II и III.
Первый класс рестриктаз включает ферменты, проявляющие активности II типа.
Среди рестриктаз типа II наиболее полно изучена рестриктаза Eco RI. Данный фермент, как
и другие рестриктазы, относящиеся к этому классу, отвечает только за акт рестрикции;
метилирование, узнаваемой рестриктазой последовательности ДНК, осуществляет совсем
иной фермент. Собственно рестриктаза Eco RI представляет собой димер, состоящий из двух
идентичных субъединиц с молекулярной массой 31 000 дальтон. Исходя из гомодимерной
структуры Eco RI можно было ожидать, что фермент действует симметрично на идентичные
последовательности двух частей сайта узнавания и разрезает обе цепи одновременно.
Однако на самом деле гидролиз происходит последовательно.
Были получены кристаллы комплекса Eco RI и олигонуклеотиды 5'TCGCGAATTCGCG-3' И проведен их рентгеноструктурный анализ. Это позволило в
деталях выяснить способ взаимодействия данного фермента с ДНК. В частности, было
показано, что между двумя остатками Arg и одним остатком Glu (в каждой из двух
субъединиц), с одной стороны, и парами оснований в сайте узнавания - с другой,
образуются водородные связи, в результате чего происходит частичное раскручивание ВДНК, облегчающие последующие разрезание.
В качестве сайтов рестрикции для рестриктаз типа II часто выступают
последовательности из 4-6 пар оснований, представляющие собой в ряде случаев
палиндромы, которые обладают симметрией второго порядка и имеют также
симметричную
модификацию,
под
которой
подразумевают
метилирование
соответствующих оснований в обеих цепях ДНК.
Поэтому становится очевидным, что сайт-мишень может быть полностью
метилирован (обе цепи молекулы ДНК модифицированы), полуметилирован
(модифицирована только одна цепь) и неметилирован. Полностью метилированный сайт не
поврежден ни рестрикции, ни модификации. Полуметилированный сайт не узнается
рестриктазой, но может быть превращен под действием метилазы в полностью
метилированный. Неметилированный сайт-мишень представляет собой субстрат для
действия как рестриктазы, так и метилазы, и может быть либо разрезан, либо метилирован.
Поскольку репликация полностью метилированного сайта всегда дает
полиметилированную ДНК, узнавание частично метилированных сайтов и добавление
недостающих метильных групп является обычным свойством метилаз in vivo.
Большинство рестриктаз типа II разрезают ДНК в неметилированных сайтах, причем
некоторые ферменты вносят ступенчатых разрывы ^образованием «липких» концов, тогда
как другие рестриктазы II типа вызывают образование «тупых» концов. Характерными
особенностями рестриктаз II типа являются, во-первых, совпадение сайта узнавания
(посадки) и сайта рестрикции, во-вторых, полное разобщение рестриктирующей и
метилирующией активностей.
Ко второму классу рестриктирующих активностей, характеризирующих систему
рестрикции и -модификации, отнесены активности ферментов типа I и III. Эти ферменты
представляют собой мультимеры, выполняющие в бактериальной клетке как
эндонуклеолитичсскую, так и метилирующую функции. Механизмы их действия отличны
друг от друга и от механизмов действия ферментов типа II. Точно неизвестно, у какой части
бактерий функционируют системы типа I или III, однако очевидно, что они менее
распространены, чем система типа II.
К наиболее известным ферментам типа I относятся рестриктазы Есо К и Есо В,
выделенные из штаммов E.coli К и E.coli В, соответственно. Данные олигомерные
рестриктазы состоят из субъединиц трех разных типов - R-субъединицы ответственны за
рестриктазную активность, М-субъединицы принимают участие в процессе метилирования
соответствующих сайтов, а S-субъединица ответственна за узнавание сайта посадки
рестриктазы в молекуле ДНК.
После того как сайт посадки полуфункционального фермента узнается Sсубъединицей. происходит связывание фермента с ДНК, что сопровождается либо
рестрикцией, либо модификацией; активности, проявляемые субъединицам R и М,
являются взаимоисключающими.
Рестриктаза Есо К имеет молекулярную массу около 400 000 дальтон. Она содержит
две R-субъединицы (по дальтон) и одну S-субъеДиницу (55 000 дальтон).
Рестриктаза Есо В состоит из субъединиц такого же размера, но их молярное
соотношение в состав фермента может быть различным. Субъединицы М и S в соотношении
1:1 могут сформировать комплекс, который проявляет функцию метилирования независимо
от рестриктазной активности. Данное явление легко объяснимо, поскольку три гена,
кодирующие каждую из субъединиц, расположены в опероне в следующем порядке: Pl-hsd
- P2-hsdM-hsdS, где Р1 и Р2 - независимые промоторы. Отсюда следует, что hsdM и hsdS
могут экспрессироваться независимо от hsdR.
Сайты узнавания ферментов Есо В и Есо К - это структуры, состоящие из двух частей.
В обоих случаях первая часть представлена специфической последовательностью из трех
пар оснований, отдельной у фермента Есо В восемью парами, а у Есо К шестью парами оснований от специфической последовательности их четырех пар
оснований:
TGANNNNNNNNTGCT
ACTNNNNNNNNACCA
Отсюда видно, что оба сайта узнавания несимметричны, однако каждый из них несет
на каждой из цепей по одному остатку аденина для метилирования, как показано
звездочками, в последовательности сайта узнавания для фермента Есо В.
Будет ли данная ДНК разрезана иль модифицирована, определяется состоянием сайтымишени. Если сайт-мишень полностью метилирован, фермент может связаться с ним, но
затем диссоциировать без проявления любой из своих активностей. Если мишень
полу метилирована, фермент модифицирует неметилированную цепь; благодаря этому
сохраняется состояние метилирования в ДНК клетки-хозяина.; Если мишень не
метилирована, ее узнавание приводит к реакции разрезания.
Источником метильных групп для модификации служит кофактор Sаденозилметионин (SAM), который в ходе реакции превращается в S-аденозилгомоцистеин
(SAH).
соон
I
CH-NH2
I
—
сн2
I
сн2
СНS-Ado
S-аденозилметионин
I
Механизм действия этих ферментов рестрикции-модификации сводится к их активации
посредством связывания SAM с М-субъединицами. На начальной стадии реакции SAM
действуют как аллостерический эффектор, т.е. изменяет конформацию белка, обеспечивая
его связывание с ДНК. Это конформационное изменение затрагивает S-субъединицу,
ответственную как за узнавание сайта посадки в молекуле ДНК, так, и непосредственно за
процесс связывания. После взаимодействия фермента с ДНК следует реакция с АТР.
В неметилированном сайте АТР индуцирует такую конформационную перестройку Rсубъединиц, которая способствует разрезанию ДНК. Для процесса рестрикции необходим
гидролиз АТР, при этом до акта разрезания ДНК от фермента отделяется кофактор SAM.
Роль АТР в случае частично метилированного сайта недостаточно ясна: в частично
модифицированном сайте недостаточно ясна: в частично модифицированном сайте
происходит Метилирование с превращением SAM в SAH. Этот процесс идет и без АТР, но
в его присутствии реакция идет более эффективно.
Для сайтов узнавания и разрезания ферментов I типа характерны необычные
взаимоотношения. Сайт разрезания может быть удален от сайта узнавания на расстоянии от
400 до 7000 пар нуклеотидов (среднее расстояние составляет около 1000 пар оснований).
Разрезание производится не в специфической последовательности, но и не в случайном
сайте: имеются области, предпочтительные для событий рестрикции. Реакция разрезания
протекает в две стадии. Сначала разрезается одна цепь ДНК, а затем рядом другая. В
областях, прилегающих с каждой стороны к сайту разрезания, может происходить
экзонуклеотическая деградация ДНК. Принтом происходит эффективный гидролиз АТР,
роль которого пока не выяснена.
Каким же образом фермент узнает один сайт, а разрезает другой, достаточно
уделенный? Важно отметить, что белок никогда не отделяется от молекулы ДНК, с которой
он первоначально связался. Следовательно, узнавая сайт связывания, белок не отделяется от
метилированной ДНК для того, чтобы? найти сайт разрезания. Существуют две
альтернативные модели, объясняющие взаимосвязь между сайтами; узнавания и разрезания:
в соответствии с одной из них фермент движется по молекуле ДНК, согласно другой
модели, перемещается ДНК.
Если движется фермент, то его перемещение вдоль ДНК будет продолжаться до тех
пор, пока он не сделает выбор сайта разрезания. Если же движется ДНК, то фермент
остается прикрепленным в сайте узнавания, а ДНК протаскивается через второй активный
центр на ферменте, и это продолжается до тех пор, пока область разрезания (еще не
охарактеризованная) не попадает в этот центр. Полученные в самое последнее время
электронно-микроскопические данные свидетельствуют, что фермент вызывает
образование петли в ДНК и остается, по-видимому, связанным с сайтом узнавания, а это, в
свою очередь, подтверждает вторую модель взаимосвязи сайтов узнавания и разрезания.
Наиболее детально изученными ферментами рестрикции и модификации тип III является
Eco P1 и Нсо PI5, кодируемые плазмидами Р1 и Р 15 у Escherichia coli и Hinf I
обнаруженный у Haemophilus influenzae серотипа Rf.
Каждый фермент состоит из субъединиц двух типов, а именно: R-субъединицы,
ответственной за рестрикцию (молекулярная масса 106 000-110 000 дальтон), и MSсубъединицы, ответственной как за узнавание, так и за модификацию (молекулярная масса
73 000-80 000 дальтон). У ферментов типа III рестрикционная и модифицирующая
активности выражаются одновременно.
Сначала фермент присоединяется кевоему сайту на ДНК (данное взаимодействие
представляет собой АТР-зависимый процесс). Затем активности модификации и рестрикции
начинают конкурировать друг с другом за вступление в реакцию с ДНК. Метилирование
ДНК происходит в сайте посадки фермента, что согласуется с объединением двух функций метилирования и узнавания в одной MS- субъединице. Рестрикционное разрезание
происходит на расстоянии 24-26 пар оснований от сайта узнавания. Рестрикция сводится к
внесению ступенчатых разрезов с образованием «липких» концов, имеющих уступы из 2-4
оснований.
Ферменты метилируют остатки аденина, однако сайты-мишени для Р1 и Р 15 имеют
загадочное свойство. Они могут быть метилированы только на одной цепи. Ниже приведены
последовательности этих сайтов:
AGACC
PI
TCTGG
CAGCAG
Р 15
GTCGTC
Возникает закономерный вопрос: «Как сохраняется состояние метилирования после
репликации?» На рис.,
приведенном ниже, показано, что в процессе репликации
формируется два типа сайтов.
AGACC
TCTGG
AGACC репликация
TCTGG
-------------- ►
Родительский
AGACC
сайт
TCTGG
Результат
репликации
Одна реплика содержит исходную метилированную цепь и фактически не отличима от
родительской. Другая реплика полностью неметилирована и поэтому представляет собой
последовательность-мишень для рестрикии или модификации. Чем объяснить, что из этих
двух возможностей чаще реализуется вторая? Ответ на данный вопрос в настоящее время
неизвестен. Однако одно из возможных объяснений состоит в том, что реакция
метилирования непосредственно связана с актом репликации. Достаточно вспомнить
функционирование системы исправления ошибок спаривания при репликации.
Литература:
1. Молекулярная биология: Структура рибосом и биосинтез белка / Под ред.
А.С.Спирина. М.: Высшая школа, 1986.
2. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. М.: Высшая
школа, 1996.
Вопросы для самоконтроля:
Процессы рестрикции и модификации
Неделя 11
Кредит час 21
Лекция № 11
Тема: Контроль генной экспрессии у прокариот.
Цель: ознакомиться с процессом контроля генной экспрессии у прокариот
Содержание лекции:
Бактериям необходимо уметь адекватно и оперативно отвечать на постоянно
изменяющиеся внешние условия. ИХ выживаемость напрямую зависит от способности
быстро переключать метаболизм с использования одного субстрата на утилизацию другого.
В первую очередь это касается способности бактериальных клеток использовать самые
разные соединения, представляющие собой источники важнейших элементов - С и N,
содержание которых в окружающей среде постоянно изменяется.
Одноклеточные эукариоты также способны реагировать на постоянно меняющийся
состав среды обитания. Сложно устроенные многоклеточные организмы имеют более
постоянный набор метаболических путей и могут не отвечать на изменение внешних
условий перестройкой своего метаболизма.
Легкая приспособляемость является характерной особенностью бактерий. Вместе с тем
им необходима экономичность. Включение альтернативных метаболических путей при
изменении условий окружающей среды сопряжено, как правило, с большими
энергетическими и пластическими затратами. Совершенно очевидно, что было бы
нерационально продолжать синтезировать все ферменты метаболических путей, которые не
могут быть использованы в данный момент вследствие отсутствия соответствующих
субстратов. Бактерия идет по компромиссному пути: она не синтезирует ферменты тех или
иных путей в отсутствие соответствующих субстратов, но способна в любое время начать их
синтез при появлении таковых.
Этим
в
первую очередь объясняются
главные особенности организации
бактериальных генов, которые объединены в кластеры таким образом, что все ферменты,
ответственные за функционирование определенного катаболического и биосинтетического
пути, детерминируются генами, специальными друг с; другом. Как следствие, вся группа
генов транскрибируется в одну полицистронную иРНК.
У бактерий образование необходимых белков регулируется главным образом
содержанием иРНК, доступной для трансляции. Дополнительный способ поддержания
нужной концентрации клеточных белков состоит в регуляции различных этапов
трансляции, а также скорости деградации белковых.
Образование РНК у прокариот чаще всего регулируется на уровне инициации
транскрипции несколькими способами. Первый заключается в модификации структуры
РНК-полимеразы. Так, β- или β'-субъединица РНК-полимеразы E.coli может
модифицировать при заражении клеток некоторыми бактериофагами. Другой пример образование новой σ-субъединицы при спорулции определенных штаммов Bacillus. И в том
и другом случае изменяются способность РНК-полимеразы к связыванию с промотором и
скорость транскрипции соответствующих генов. Второй способ регуляции заключается в
изменении пространственной структуры ДНК, что влияет на способность РНК-полимераз
связываться с определенными промоторами и инициировать синтез РНК. И наконец,
взаимодействие РНК-полимеразы с некоторыми промоторами может ингибироваться или
стимулироваться белками, которые связываются с ДНК в месте присоединения полимеразы
или вблизи него. На связывание таких регуляторных белков репрессоров и активаторов часто влияют определенные метаболиты, играющие роль корепрессоров и коактиваторов.
Скорость элонгации РНК зависит также от вторичной структуры иРНК. В подобных
случаях за прекращение или продолжение транскрипции отвечают определенные
нуклеотидные последовательности и белки. Вторичная структура транскриптов может
влиять на их стабильность, при этом особую роль в; определении продолжительности жизни
РНК в клетке играет структура 3'-конца. Одни иРНК очень стабильны и участвуют во
многих циклах трансляции. Контроль на уровне транскрипции особенно важен в случае
наименее стабильных иРНК. Как уже указывалось, зрелые молекулы рРНК и тРНК
являются продуктами процессинга первичных транскриптов. Посттранскрипционные
события, в свою очередь, тоже регулируются, и от них содержание в клетке
функциональных молекул РНК.
Конститутивные и индуцируемые ферменты
Все живые клетки имеют четко функционирующие механизмы, позволяющие
регулировать синтез различных белков таким образом, что в любой клетке присутствует
заданное количество молекул каждого белка, позволяющее ей осуществлять свои
метаболические процессы плавно и с максимальной эффективностью. ДНК клеток E.coli
содержит гены, кодирующие более 3000 разных белков. Однако эти 3000 белков
присутствуют в бактериальной клетке в различных количествах. В каждый момент времени
число копий отдельных белков может быть различным. Более того, число копий некоторых
из них велико и постоянно. Например, одна клетка E.coli содержит около 15 000 рибосом, а
это означает, что каждый из 50 белков, входящих в состав одной рибосомы, должен
присутствовать в клетке в количестве 15 000 копий.
К таким же белкам, которые присутствуют в клетке в большом количестве и уровень
которых всегда постоянен, относятся ферменты гликолитического пути расщепления
глюкозы. Белки или ферменты, постоянно присутствующие в клетке в большом количестве
копий, называются конститутивными.
С другой стороны, некоторые ферменты, например β-галактозидаза, обычно
присутствуют в клетке; E.coli в очень в небольших количествах - всего около 3-5 молекул.
Функция β-галактозидаза, сводится к расщеплению молекул β-галактозидазов на
составляющие их сахара. Типичным примером таких β-галактозидазов является молочный
сахар-лактоза, расщепляющийся под действием фермента на моносахариды глюкозу и
галактозу, которые впоследствии используются в дальнейших катаболических реакциях.
В отсутствие субстрата - лактозы бактериальная клетка нуждается в большом
количестве β-галактозидазы. Однако количество этого фермента может резко возрасти в
ответ на изменения в доступности питательных веществ в окружающей среде. При
добавлении в среду лактозы в бактериальных клетках уже через 2-3 мин начинает
проявляться повышенная активность р-галактозидазы и вскоре количество фермента в
расчете на одну клетку достигает величины, превышающей 5000 молекул. В отдельных
случаях на долю р-галактозидазы может приходиться до 5-10% общего растворимого белка
клетки. С другой стороны, при удалении из среды лактозы синтез фермента прекращается
так же быстро, как был начат. Благодаря регуляции синтеза ферментов, в любых клетках
создается определенный набор ферментов, обеспечивающий в каждый данный момент
нормальное протекание основных метаболических процессов. Регуляция позволяет также
белков, которые необходимы только в определенной ситуации и в течение
непродолжительного промежутка времени.
Белки или ферменты, количество которых может существенно увеличиться под
действием какого-либо химического фактора окружающей среды, называют индуцируемыми
или индуцибельными.
Само явление ускоренного синтеза ферментов при выращивании бактерий только на
определенных субстратах получило название индукции ферментов. Типичным примером
является уже упомянутая индукция β-галактозидазы.
Подобная реакция на изменение состава питательных веществ наблюдается не только
при необходимости использовать новые субстраты; она используется так же для
выключения новых.
Литература:
1. Уотсон Дж. Молекулярная биология гена. М.: Мир, 1978.
2. Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Высшая школа, 1990.
3. Молекулярная биология: Структура рибосом и биосинтез белка / Под ред. А.С.Спирина.
М.: Высшая школа, 1986.
4. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. М.: Высшая школа,
1996.
Вопросы для самоконтроля:
Конститутивные и индуцируемые ферменты
Неделя 12
Кредит час 23
Лекция № 12
Тема: Генетические механизмы эволюции прокариот.
Цель: ознакомиться с генетическими механизмами эволюции прокариот.
Содержание лекции:
Вся информация о признаках, присущих организму, сосредоточена в его
генетическом аппарате. Он обеспечивает сохранение и воспроизведение этих признаков в
процессе размножения организма, так как возникающие дочерние особи обнаруживают в
большинстве случаев полное сходство с родительскими формами. Это говорит о том, что
генетический аппарат обладает высокой стабильностью и точностью механизмов,
обеспечивающих его функционирование. Однако стабильность генетического аппарата не
абсолютна, так как это исключало бы всякую возможность его изменений, и, следовательно,
эволюционных преобразований, приведших в конечном итоге к возникновению
разнообразных форм жизни, свидетелями (и представителями) которых мы являемся. Таким
образом, генетический аппарат должен быть организован так, чтобы, с одной стороны,
обеспечивать свою стабильность, с другой - быть достаточно пластичным, т.е. обладать
способностью к изменчивости.
Генетический аппарат прокариот
Как это ни кажется в настоящее время парадоксальным, но до 40-х гг. нашего столетия
немногие микробиологи думали, что бактерии обладают наследственностью, основанной на
тех же принципах, которые установлены для высших организмов. Прокариоты не имеют ни
оформленного ядра, ни хромосом, аналогичных таковым эукариотных клеток, поэтому
считали, что бактерии в генетическом отношении представляют собой неупорядоченную
форму жизни. Одним из первых к пониманию того, что бактерии и. высшие организмы
подчиняются общим генетическим законам, подошел М.Бейеринк, описавший у прокариот
стабильные, легко распознаваемые и наследуемые изменения.
Генетический материал любой клетки представлен ДНК, информационные свойства
которой определяются специфической последовательностью четырех нуклеотидов в
полинуклеотидной цепи. Полуконсервативный механизм репликации ДНК, в результате
которого из одной вновь синтезированной комплементарной полинуклеотидной цепи,
наилучшим образом обеспечивает идентичность исходной и синтезированных молекул и,
следовательно, сохранность видоспецифической наследственной информации в ряду
поколений клеток и организмов. Частота ошибок, возникающих в процессе репликации,
порядка 10-7 .
Реализация наследственной информации в процессе жизненного цикла (онтогенеза)
организма -двухступенчатый процесс. Сначала с определенных участков ДНК информация
переписывается
(транскрибируется)
в
виде
комплементарных
нуклеотидных
последовательностей молекул и РНК, которая перемещается в цитоплазму, связывается с
рибосомами и в рибосоме с иРНК осуществляется перевод (трансляция) генетической
информации в определенную последовательность аминокислотных остатков молекулы
белка.
Процесс транскрипции находится «в клетке под строгим контролем, поэтому имеет
место как-неодинаковое транскрибироваться. В результате количество молекул иРНК в
клетке, комплементарных разным генам, сильно различается. Хотя в целом механизмы
синтеза ДНК и РНК сходны, процесс транскрипции не обладает той степенью точности,
которая характерна для репликации ДНК. Однако поскольку иРНК не способна к
самовоспроизведению, возникающие при ее синтезе ошибки в последующих клеточных
генерациях не воспроизводятся и, следовательно, не могут наследоваться.
Информационные РНК служат матрицами для синтеза различных белковых молекул.
Перевод генетической информации с «языка» нуклеотидов на «язык» аминокислот сложный многостадийный процесс, включающий активацию аминокислот, образование
ими комплексов с особым видом РНК (транспортными РНК, или тРНК), взаимодействие
этих комплексов с иРНК. связанной с рибосомой, приводящее в конечном итоге к
формированию полипептидной цепи, аминокислотный состав которой изначально
запрограммирован в определенном участке ДНК. В осуществлении каждой из стадий,
ведущих к синтезу молекулы белка, участвует несколько различных ферментов.
Хотя механизм трансляции отличается высокой точностью, вероятность ошибки в
целом выше, чем в случае синтеза молекул ДНК и РНК. Наиболее уязвимый этап «узнавание» с помощью фермента аминокислоты соответствующей молекулой тРНК. По
имеющимся данным, частота возникновения ошибок на этом этапе порядка 10-4 , что и
определяет, возможно, уровень точности процесса синтеза белка в целом. Однако, как и в
случае синтеза РНК, ошибки в процессе трансляции, производящие к синтезу измененной
молекулы белка, не воспроизводятся, если они не закодированы исходно в генетическом
материале.
Таким образом, процессы транскрипции и трансляции, служащие для выражения в
онтогенезе генетической информации, не приводят к наследованию изменений,
возникающие в молекулах ДНК, могут сохраняться в ряду поколений, поскольку они
воспроизводятся в процессе репликации. Следовательно, в основе эволюции прокариот
лежит способность к изменению только их генетического материала. У прокариот весь
генетический материал, необходимый для жизнедеятельности, локализован в одной
хромосоме, т.е. бактериальная клетка гаплоидна. В определенных условиях в клетках
бактерий может содержаться по нескольку копий хромосомы.
У многих бактерий обнаружены нехромосомные генетические элементы: плазмиды,
умеренные фаги и
мигрирующие элементы (транспозоны и
IS-элементы). Для
плазмид
характерно
стабильное существование в нехромосомном состоянии.
Транспозоны и IS-элементы входят, как правило, в состав хромосом, но способны
переходить из хромосомы в плазмиду, поэтому также могут быть отнесены к
нехромосомным генетическим элементам.
Изучение нехромосомных генетических элементов обнаружило, что общий ДНК,
входящий в их состав, превышает объем генома каждой особи. Таким образом, у прокариот
большой объем генетической информации оказывается рассредоточенным в нехромосомных
элементах. Это заставляет по-новому подходить к вопросу об организации генетической
информации в мире прокариот. В бактериальной хромосоме локализована генетическая
информация, необходимая для существования конкретного вида бактерий в определенном
диапазоне условий внешней среды: при наличии используемых источников углерода, азота,
доступности или отсутствии молекулярного кислорода и т.д. Особенностью генетической
информации, содержащейся в нехромосомных элементах, является ее необязательность для
жизнедеятельности бактерий, т.е. в ее отсутствие бактериальная клетка жизнеспособна, но,
как видно из" дальнейшего материала, важная роль нехромосомных генетических элементов
заключается в том, что они расширяют возможности существования бактериального вида,
обеспечивают обмен генетическим материалом на большие расстояния по горизонтали и
играют определенную роль в эволюции прокариот.
Плазмиды обнаружены у многих бактерий, принадлежащих к разным
таксономическим группам. Количество плазмидной ДНК в клетке составляет обычно не
более нескольких процентов от клеточного генома, а число плазмид состоит из трех групп
генов: участка ДНК, ответственного за автономную репликацию плазмиды в клетке;
системы генов, обеспечивающих возможность переноса плазмид из одной клетки в другую;
генов, определяющих свойства, полезные для клетки-хозяина. Отличительная особенность
плазмид — способность к автономной репликации, поэтому минимальное количество ДНК,
которое может быть названо плазмидой, - это фрагмент, обеспечивающий автономную
репликацию плазмидной ДНК в клетке как единого целого.
Обычно о присутствии плазмид в бактериальной клетке судят по проявлению
определенных признаков, к которым относится устойчивость к отдельным лекарственным
препаратам, способность к переносу генов при конъюгации, синтез веществ
антибиотической природы, способность использовать некоторые сахара или обеспечивать
деГрадацию ряда веществ. Из перечисленного выше видно, что плазмиды делают
возможным существование организмов в более широком диапазоне условий внешней среды,
т.е. действуют как факторы адаптации. Большую группу составляют плазмиды с
нерасшифрованными функциями; такие плазмиды выявляют с использованием физикохимических методов.
Мигрирующие элементы, представленные транспозонами и IS-элементами, - это
линейные молекулы двухнитевой ДНК, размеры которых колеблются от 200 до 6000 пар
нуклеотидов. Отличительная особенность мигрирующих элементов - их неспособность к
автономной репликации. Мигрирующие элементы могут встраиваться в разные участки
бактериальной хромосомы или мигрировать с бактериальной хромосомы на плазмиду; их
репликация осуществляется под контролем тех же механизмов, что и у соответствующей
хромосомы или плазмиды. Частота переносов (транспозиции) мигрирующих элементов
колеблется от 10-4 до 10-7 . IS-элементы содержат информацию, необходимую только для их
переноса внутри клетки, никаких выявляемых признаков в них не закодировано.
Транспозоны устроены более сложно: в них включены некоторые гены, не имеющие
отношения к процессу транспозиции. Известны транспозоны. содержащие гены
устойчивости к антибиотикам, ионам тяжелых металлов и другим ингибиторам.
Для переноса мигрирующих элементов между клетками нужен переносчик, которым
могут быть определенные плазмиды или фаги. Встраивание мигрирующих элементов в
бактериальную хромосому оказывает мутагенное действие, так как при этом происходит
включение фрагмента ДНК, приводящее к изменению порядка расположения нуклеотидов в
триплете и, как следствие этого, нарушению процесса транскрипции.
Изменение генетического материала
Первое, что поразило исследователей, когда они поближе познакомились с миром
прокариот, - огромное разнообразие присущих им признаков. Это послужило в свое время
основанием для дискуссии о: том, существуют ли у прокариот реально очерченные виды,
между которыми нет переход, или же имеет место почти бесконечная вариабельность
одного вида, так что в конечном итоге само понятие «вид» применительно к этим
организмам теряет тот смысл, который в него вкладывается. Спор был разрешен после
разработки Р. Кохом метода чистых культур. Было доказано, что и у бактерий вид - это
реальность. Представления о простоте переходов между родами и видами оказались
неверными.
В процессе экспериментальной работы с прокариотами исследователи часто
наблюдали, что популяция одного вида при культивировании в течение длительного
времени или в разных условиях подвержена изменениям. Накопилось огромное количество
фактов, иллюстрирующих эти изменения, однако механизмы, лежащие в основе
наблюдаемых явлений, были непонятны. И только успехи, достигнутые за последние
десятилетия в области изучения строения и функционирования генетического аппарата
прокариот, позволили разобраться в этом вопросе.
Прежде чем переходить к дальнейшему изложению материала, целесообразно ввести
некоторые понятия. Генотипом, или геномом, называют совокупность всех генов,
присущих данному организму, т.е. его генетическую конституцию. Под фенотипом
понимают совокупность признаков, присущих данному организму. Оказалось, что все
наблюдаемые изменения можно разделить на два типа. К первому относят те же из них,
которые, как правило, проявляются у проявляются у подавляющего большинства особей в
популяции при изменении внешних условий и наблюдаются до тех пор, пока действует
фактор, вызвавший эти изменения. Такой тип изменчивости получил название
ненаследственного, или модификационного, а само явление названо модификацией.
Ко второму типу относятся изменения признаков, которые первоначально возникают
как редкие события в популяции особей (с частотой на 10-4-10-11 клеток). Если измененные
особи имеют некоторое преимущество перед неизмененными, выражающееся в повышенной
скорости роста или жизнеспособности, они постепенно накапливаются в популяции и
вытесняют исходные особи. Изучение особенностей второго типа изменений привело к
заключению, что последние возникают случайно. И наконец, эти изменения постоянны, т.е.
передают из поколения в поколение при размножении организма. Такой тип изменчивости
был назван наследственным.
Долгое время не было ясно, каков механизм модификационных изменений, могут ли
они наследоваться и какова их роль в эволюции организмов. В настоящее время показано,
что модификация -изменение, происходящее на уровне фенотипа и не затрагивающее
клеточный генотип. Все признаки клетки определяются ее генотипом, но в определенных
условиях она пользуется на всей заложенной в ней генетической информацией, количество
которой гораздо больше, чем необходимо клетке для существования в конкретных условиях.
Реакция клетки на изменение внешних условий приводит к проявлению каких-то новых
признаков, свойств, которые не обнаруживались в исходной культуре. Однако информация,
необходимая для проявления этих признаков, обязательно содержится в клеточном геноме.
Модификация есть результат пластичности клеточного метаболизма, приводящего к
фенотипическому проявлению «молчащих» генов в конкретных условиях. Таким образом,
модификационные изменения имеют место в рамках неизменного клеточного генотипа.
Существует несколько типов модификационных изменений. Наиболее известны
адаптивные модификации, т.е. ненаследственные изменения, полезные для организма и
способствующие его выживанию в изменившихся условиях. Причины адаптивных
модификаций кроются в механизмах регуляции действия генов. Адаптивной модификацией
является адаптация клеток E.coli к лактозе как новому субстрату. У ряда бактерий
обнаружена универсальная адаптивная реакция в ответ на различные стрессовые воздействия
(высокие и низкие температуры, резкий сдвиг рН и др.), проявляющаяся в ; интенсивном
синтезе небольшой группы сходных белков. Такие белки получили название белков
теплового шока, а само явление - синдром теплового шока.
Литература:
1. Молекулярная биология. Учебное пособие для студентов медицинских вузов Автор:
Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Изд-во: Медицинское информационное агентство,
2007. С. 536
2. Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Академия, 2011.
3. Бокуть С.В., Герасимович Н.В., Милютин А.А. Название: Молекулярная биология,
изд-во:Вышэйшая школа, Год: 2005
Вопросы для самоконтроля:
Генетический аппарат прокариот
Изменение генетического материала
Неделя 13
Кредит час 25
Лекция № 13
Тема: Цикл репродукции вирусов.
Цель: изучить цикл репродукции вирусов
Содержание лекции:
Прежде чем рассмотреть цикл репродукции вирусов, подчеркнем, что отношения
вируса с клеткой хозяина могут складываться по-разному. Условно эти отношения можно
свести к трем типам.
Продуктивная инфекция наблюдается в том случае, когда цикл репродукции вируса в
клетке хозяина завершается образованием нового, как правило, многочисленного поколения
вирусов, что обычно сопровождается гибелью клетки хозяина.
Абортивная инфекция имеет место, если цикл репродукции вируса в клетке хозяина
внезапно прерывается на одной из стадий - репликации нуклеиновой кислоты вируса, или
синтеза белков капсида. или на стадии сборки новых вирионов. В этом случае клетка
сохраняет свою жизнеспособность.
Вирогения характеризуется интеграцией (встраиванием) вирусной нуклеиновой кислот
в геном клетки хозяина, что приводит в дальнейшем к синхронной репликации ДНК клетки и
нуклеиновой кислоты вируса. Клетка хозяина продолжает жизнь.
По типу вирогении складываются отношения умеренных фагов с бактериями, сто
приводит к лизогенизации клетки хозяина.
Вирусы, в отличие от всех про- и эукариотных организмов, не способны размножаться
бинарным делением. Размножение вирусов осуществляется путем репродукции их в клетке
хозяина. Репродукция отдельных компонентов вириона - нуклеиновых кислот и белков -
происходит территориально в разных участках клетки и разновременно. Цикл репродукции
представляет собой уникальный процесс подчинения клеточных матричногенетических
механизмов чужеродной вирусной информации. Многие стадии этого процесса до сих пор
не расшифрованы.
Поскольку вирусы лишены автономного обмена веществ, они не нуждаются в
ферментах, осуществляющих процессы метаболизма. Однако к настоящему времени в
составе различных вирусов открыты около 10 ферментов. Функционально ферменты
вирусов можно подразделить на 2 группы: ферменты, способствующие проникновению
вирусной нуклеиновой кислоты в клетку и выходу образовавшихся вирионов в среду
(нейтраминидаза миксовирусов, АТФ-аза и лизоцим некоторых фагов и др.), и ферменты,
участвующие в процессах транскрипции и репликации вирусной нуклеиновой кислоты
(различные транскриптазы и репликазы).
Ферменты вирусов входят в состав самого вириона либо синтезируются на рибосомах
клетки по информации, закодированной в геноме вируса. Помимо этого, в цикле
репродукции
вируса
принимают"
участие
некоторые
клеточные
ферменты,
модифицированные вирусов в процессе его взаимодействия с клеткой.
Рассмотрим цикл репродукции вирусов на примере вирусов животных. Цикл
репродукции можно подразделить на отдельные стадии.
I стадия - хемосорбция вируса на поверхности клетки хозяина.
Хемосорбция возможна лишь при условии, если клетка несет на своей поверхности
чувствительные рецепторы, комплементарные рецепторам данного вируса. В клетках
животных и человека функцию рецепторов для пикорна- и арбовирусов выполняют
липопротеиды, для миксо- и парамиксовирусов и аденовирусов - мукопротеиды. Так, для
вируса гриппа клеточным рецептором является гликопрогеид, включающий нейраминовую
кислоту, которая разрушается нейраминидазой вируса.
У простоорганизованных вирусов рецепторами являются уникальные сочетания
белковых субъединиц, находящиеся на поверхности капсида (гемагглютинины орто- и
парамиксовирусов, решетчатые поверхности из гликопротеидов у альфавирусов). У более
сложноорганизованных вирусов рецепторов выполняют выросты суперкапсида в виде
шипов или ворсинок.
II стадия - проникновение вирусов ь клетку хозяина.
Пути проникновения вирусов в клетку могут быть различны. Предполагается, что
многие вирусы проникают в клетку путем пиноцитоза, или виропексиса. При пиноцитозе в
районе хемосорбции вируса клеточная мембрана образует инвагинацию и заглатывает вирус.
В составе пиноцитарной вакуоли вирус. • окруженный участком цитоплазматической
мембраны клетки, попадает в цитоплазму.
Некоторые вирусы проникают в клетку за счет слияния клеточных и вирусных
мембран. В результате вирусная нуклеиновая кислота оказывается в цитоплазме клетки, а
белковый капсид вируса остается на ее поверхности.
Проникновение фаговой ДНК в бактериальную клетку происходит за счет частичного
разрушения оболочки клетки фаговым лизоцимом и сократительной реакции отростка
фага. В цитоплазму клетки проникает только нуклеиновая кислота фага, в то время как
белковый капсид его остается снаружи.
III стадия - депротеинизация вируса.
Процесс депротеинизации вируса предусматривает освобождение его нуклеиновой
кислоты от белков капсида. У многих вирусов депротеинизация идет параллельно
процессам хемосорбции и пиноцитоза. Пока вирус находится в пиноцитарной вакуоли,
протеолитические ферменты клетки разрушают его белковую оболочку. Как только
вирусная нуклеиновая кислота освобождается от белков капсида, наступает так
называемый скрытый период - период эклипса. Предполагается, что в период эклипса
вирусная нуклеиновая кислота проходит по цитоплазме клетки в район ядра. Остается
загадкой, почему клеточные нуклеазы не разрушают нуклеиновую кислоту вируса. У
разных вирусов период эклипса длится от нескольких минут до несколько часов.
IVстадия - синтез компонентов вируса.
Совокупность процессов этой стадии можно подразделить на три этапа:
Первый этап - подготовительный. Он преследует две цели: подавить
функционирование: генетического аппарата клетки, прекратить синтез клеточных белков и
нуклеиновых кислот, перевести; белок-синтезируюший аппарат клетки под контроль генома
вируса; подготовить условия для репликации нуклеиновой кислоты и синтеза белков
капсида вируса.
Второй этап - репликация нуклеиновой кислоты вируса. Поскольку генетический
аппарат вирусов весьма разнообразен, то и механизмы выражения генетической
информации вирусов имеют существенные различия. Так, для двухцепочечных ДНКгеномных вирусов характерен такой же путь реализации генетической информации, как и
для других живых организмов. Процессу репликации ДНК предшествует транскрипция
иРНК. У вирусов этот процесс ведет ДНК-зависимая РНК-полимераза клетки или самого
вируса. Информационная РНК вируса транслируется рибосомами клетки и на вирусполисоме по матрице иРНК идет синтез ранних вирус-специфических белков. К ним
относятся: ферменты, участвующие в транскрипции и репликации вирусной ДНК (РНК- и
ДНК-полимеразы, лигазы); белки-ингибиторы, блокирующие синтез клеточных
нуклеиновых кислот и белков; нуклеазы, разрушающие нуклеиновые кислоты клетки.
Как только синтезировались ранние вирусспецифические белки, начинается процесс
репликации ДНК вируса. Репликация двухцепочечной ДНК-чируса идет по принципу
репликации ДНК клеточных организмов полуконсервативным путем. В процессе
репликации
на
каждой
раскручиваемой
цепи
ДНК
достраивается
новая комплементарная цепь. В результате образуются дочерние молекулы ДНК точные
копии родительской ДНК вируса. Репликация ДНК у большинства вирусов происходит в
ядре клетки и лишь в единичных случаях в цитоплазме (вирусы группы оспы).
Процесс репликации одноцепочечной ДНК начинается с синтеза ее комплементарной
пары. В результате образуется двухцепочечная кольцевая родительская ДНК, получившая
название репликативной формы (РФ). Дальнейшая репликация репликативной формы
родительской ДНК вируса идет по классическому полуконсервативному механизму.
Изучение механизма репликации РНК-геномных вирусов началось с 1961 г., когда
были открыты -РНК-геномные фаги. И сразу встал вопрос: может ли вирусная РНК
реплицироваться самостоятельно или она должна сначала транскрибироваться в ДНК?
У многих одноцепочечных РНК-геномных вирусов функцию иРНК выполняет
нуклеиновая кислота самого вируса. РНК вируса транслируется рибосомами клетки и служит
матрицей для синтеза ранних вирусспецифических белков, в частности РНК-зависимой РНКполимеразы. В дальнейшем РНК-полимераза осуществляет репликацию вирусной РНК,
освобожденной от рибосом. Субстратом для синтеза вирусной РНК служат нуклеотиды
клетки. Процесс репликации РНК-вирусов осуществляется как в цитоплазме, так и в ядре
клетки.
Таким образом, у РНК-геномных вирусов молекула РНК одновременно является
генетическим материалом и выполняет функцию иРНК.
В 1970 г. в составе онкогенных РНК-вирусов был обнаружен фермент РНК-зависимая
ДНК-полимераза, свидетельствующая о наличии процессе обратной транскрипции. Позднее
было показано, что у онкогенных РНК-вирусов по матрице их РНК с участием РНКзависимой ДНК-полимеразы, содержащейся в вирионе, транскрибируется ДНК-копия.
Последняя представляет собой одноцепочечную ДНК, строго комплементарную
родительской РНК вфуса. Далее идет процесс репликации одноцепочечной ДНК с
образованием двухцепочечной репликативной формы. Последняя способна включаться в
геном клетки хозяина. Помимо этого, по матрице этой ДНК-копии реплицируются
молекулы РНК вируса при участии обычной ДНК-зависимой РНК-полимеразы. Вновь
реплицированные молекулы РНК служат компонентами ; нового поколения вирусов и
одновременно выполняют функцию иРНК.
У двухцепочечных РНК-геномных вирусов, так же как и двухцепочечных ДНКгеномных вирусов, процессу репликации нуклеиновой кислоты предшествует транскрипция
вирусной иРНК. Информационная РНК вируса транслируется рибосомами клетки с
образованием вирусспецифических белков, в частности РНК-полимеразы, при участии
которой происходит репликация двухцепочечной РНК вируса.
Третий этап - синтез белков капсида.
Этот процесс отстает во времени от процесса репликации нуклеиновой кислоты вируса
и начинается, когда репликация нуклеиновой кислоты в полном разгаре. Территориально
синтез белков капсида происходит как в ядре, так и в цитоплазме клетки. У ДНК-геномных
вирусов матрицей для синтеза белков капсида служит иРНК, транскрибированная на ДНК
вируса. У РНК-геномных вирусов матричную функцию выполняет РНК самого вируса либо
вирусспецифическая иРНК, транскрибированная на РНК вируса. Вирусспецифическая иРНК
транслируется рибосомами клетки, и на вирус-полисоме идет синтез белковпредшественников, представленных гигантскими молекулами полипептидов. Из этого
«фонда» белков-предшественников и формируются белки капсида вируса.
V стадия - сборка вирионов, или морфогенез вируса.
Как только содержание составных "компонентов нуклеиновых кислот и белков вируса
достигает в клетке определенного предела, начинается процесс сборки вирионов. У
простоорганизованных вирусов белковые субъединицы капсида в строго упорядоченном
соединении располагаются вокруг нуклеиновой кислоты. У сложноорганизованных вирусов
в
процессе
сборки
вирионов
принимают
участие
и
клеточные;
структуры
ядерная и цитоплазматическая мембраны. Так, отромиксовирусы
приобретают липополисахаридныи суперкапсид при выходе их в среду через клеточные
мембраны, а вирусы герпеса покрываются внешней оболочкой при выходе их из ядра.
VI стадия выход вирусов из клетки.
Этот процесс у разных вирусов осуществляется по-разному. Выход ДНК-геномных
фагов происходит при полном лизисе клетки фаговым лизоцимом. Сложноорганизованные
вирусы человека и животных (миксовирусы, аденовирусы и др.) выходят из клетки с
участком цитоплазмы путем почкования через цитоплазматическую мембрану и оболочку,
одновременно приобретая суперкапсид. При этом клетка некоторое время сохраняет
жизнеспособность, а затем погибает. Нередко выходу вирусов из клетки способствует
переваривание ее фагоцитами крови. Вирусы растений из клетки в клетку могут переходить
через межклеточные соединения - плазмадесмы. В некоторых случаях вирус может
длительно время находиться в клетке в латентном состоянии и передаваться дочерним
клеткам при делении материнской клетки. К латентным инфекциям относятся вирусы
герпеса.
Наиболее часто цикл репродукции вируса завершается продуктивной инфекцией образованием многочисленной популяции (100-200) полноценных вирионов, что обычно
сопровождается гибелью клетки хозяина.
Литература:
1. Уотсон Дж. Молекулярная биология гена. М.: Мир, 1978.
2. Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Высшая школа, 1990.
3. Молекулярная биология: Структура рибосом и биосинтез белка / Под ред. А.С.Спирина.
М.: Высшая школа, 1986.
4. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. М.: Высшая школа,
1996.
Вопросы для самоконтроля:
Цикл репродукции вирусов.
Неделя 14
Кредит час 27
Лекция № 14
Тема: Современные аспекты и задачи генной инженерии.
Цель: ознакомиться с основными современными аспектами и основными задачами генной
инженерии.
Содержание лекции:
По определению академика А.А. Баева, долгое время возглавлявшего работы в области
генетического инженерии в нашей стране, «генетическая инженерия представляет собой
конструирование in vitro функционально
активных
генетических
структур
(рекомбинантных ДНК) или иначе создание искусственных генетических программ».
Формально датой рождения генетической инженерии можно считать 1972 г., когда П.
Берг и сотрудники получили первую рекомбинантную ДНК. состоящую из ДНК вируса
SV40 и бактериофага λdvgal. Создание генетической инженерии имело огромное значение
для молекулярной биологии в целом. Благодаря ее методам практически структура и
функции любого гена и продуктов его экспрессии (РНК и белки) стали доступны для
исследования. Появилась возможность не только детального изучения гигантских геномов
высших организмов, но и целенаправленного изменения их структуры. Создались условия
для создания генетически трансформированных видов микроорганизмов, растений и
животных, способных стать продуцентами биологически активных соединений (ферментов,
гормонов, антибиотиков и т.п.), т.е. была создана база для развития новых биотехнологий.
Триумф генетической инженерии в конце XX в. связан в развитием в ее недрах новых,
быстро; совершенствовавшихся методов исследований. Среди этих методов следует
выделить основные пять:
> расщепление ДНК (рестрикция), что необходимо для выделения генов и манипуляций
с ними;
> гибридизация нуклеиновых кислот, которая благодаря их способности связываться
друг с другом по комплементарному принципу, позволяет специфические
последовательности ДНК и РНК, а также совмещать различные генетические
элементы; используется в цепной полимеразной реакции для амплификации ДНК in
vitro;
> клонирование ДНК, осуществляемое путем введения фрагментов ДНК или их групп в
быстро реплицирующиеся генетические элементы (плазмиды и вирусы), что дает
возможность размножать гены в клетках бактерий, дрожжей и эукариот;
> определение нуклеотидных последовательностей (секвенирование) в клонируемом
фрагменте ДНК, что позволяет определить структуру генов и аминокислотную
последовательность кодируемых ими белков;
> химико-ферментативный синтез полинуклеотидов, часто необходимый для
целенаправленной модификации генов и облегчения манипуляции с ними.
> Следует отметить, что возникновение генетической инженерии было напрямую
связано с открытием целой серии ферментов, оказавшихся незаменимыми
инструментами
для манипулирования с генами, ввиду практически полного
отсутствия соответствующих химических методов,
позволяющих
получать,
модифицировать и амплифицировать рекомбинантные молекулы ДНК. Ниже, в
разделе, посвященном рестрикции, приведен перечень наиболее важных;
ферментов, используемых в генетической инженерии.
Рестрикция ДНК
Рестрикция ДНК достигается с помощью специфических ферментов - рестриктаз. Они
представляют собой эндонуклеазы бактериального происхождения, предназначенные для
защиты клеток бактерий от чужеродной (вирусной) ДНК.
Рестриктазы способны осуществлять разрывы межнуклеотидных (фосфодиэфирных)
связей внутри полинуклеотидных цепей ДНК. Впервые рестриктазы были выявлены в
клетках кишечной палочки (E.coli), зараженных бактериофагом X. При этом оказалось, что
фаговое потомство, выращенное на двух различных штаммах этой бактерии, с различной
интенсивностью размножается в клетках противоположных штаммов.
Так, фаг, выращенный на штамме С, плохо размножался в клетках бактерии штамма
К12. Это ограничение развития (рестрикция) бактериофага, как оказалось связано с
эндонуклеазной деградацией его ДНК.
Сама
клеточная
ДНК
защищается
от
рестриктаз штаммоспецифической модификацией метилированием части нуклеотидов,
котсрое осуществляется особым ферментом - ДНК-метилазой. Чаше всего продуктами
метилирования являются 6-метиладенин и 5-метилцитозин.
Таким образом, присутствие в клетках бактерий двух ферментов (рестриктазы и ДНКметилазы) обеспечивает комплексную защиту ее ДНК. Эта система рестрикции модификации (R-M-система),; вероятно, препятствует скрещиванию между разными
видами и штаммами бактерий и тем самым' обеспечивает сохранность их видов в
эволюции.
В генетической инженерии рестриктазы используются для фрагментации молекул ДНК
при создании рекомбинантных геномов. Начиная с первых работ Д.Натанса и Г. Смита
(1962), число открытых рестриктаз быстро росло, и в 1973 г. Смит и Натане предложили
номенклатуру рестриктаз, которая следующие пункты:
1) название рестриктазы формируется из родового и видового названия
микроорганизма-хозяина, содержащего R-M-систему; при этом к первой заглавной
букве родового названия добавляются две первые строчные буквы вида,
например: Escherichia coli-Eco, Haemophilus influenzae- Hin;
2) за родо-видовым названием, в случае необходимости, приводится обозначение
штамма (Есо В) или серотипа (Hin d);
3) различные R-M-системы, присущие одному виду бактерий обозначаются
римскими цифрами: Hin I, Hin II, Hin III;
4) если R-M-система локализована в геноме плазмиды, то после родо-видового
названия указывается символ плазмиды: Есо RI.
Основой для классификации рестриктаз служат характер их воздействия на ДНК и
зависимость от кофакторов. Среди нескольких тысяч известных к настоящему времени
рестриктаз выделяют 3 класса (типа).
Рестриктазы типа I содержат три неидентичных субъединицы с мол. массами 135,60
кДа (а, Р и X) и массой эпимолекулы около 500 кДа. Эти рестриктазы специфичны к
неметилированной двуцепочечной ДНК и требуют в качестве кофакторов Sаденозилметионин (донор метильных групп в реакции метилирования), АТР и Mg2+.
Субъединицы рестриктаз типа I имеют различные функции: а-субъединицы проводят
расщепление ДНК, Р-субъединицы способны метилировать ДНК, Х-субъединицы
осуществляют узнавание специфических последовательностей ДНК.
В то же время разрывы в цепях ДНк под действием этих рестриктаз происходят
случайным образом на значительном расстоянии от участка узнавания, а продукты
расщепления оказываются весьма гетерогенными, что затрудняет их использование в
генетической инженерии.
Рестриктаза типа II состоят из двух субъединиц одного вида, имеют массу
эпимолекулы около 100 кДа и нуждаются для осуществления нуклеазной активности
только в ионах Mg + (Метилазы этой системы являются самостоятельными ферментами).
Рестриктазы этого типа узнают в ДНК последовательности из 4-8 нуклеотидов,
имеющие ось симметрии второго порядка (палиндромы).
Они гидролизуют фосфодиэфирные связи в двух цепях ДНК, осуществляя либо
симметричные, либо несимметричные разрывы в зоне палиндрома. В первом случае
образуются так называемые «тупые концы»:
Высокая специфичность действия, приводящая к образованию определенных
участков (сайтов) рестрикции, определила повышенный интерес к рестриктазам типа II,
которые стали важнейшим инструментом генетической инженерии. Целенаправленный
поиск рестриктаз этого типа, позволяющих проводить картирование геномов по различным
сайтам рестрикции, а также выщеплять определенные участки, расположенные между
этими сайтами (рестрикционные фрагменты), и далее комбинировать эти участки. привел к
тому, что число известных рестриктаз типа II стало быстро нарастать. Если в 1976 г. были
открыты 84 таких рестриктазы, то к 1995 г. стало известно 2400 рестриктаз этого типа,
имеющих 188 специфических сайтов рестрикции. Выделенные из разных источников, но
имеющие одинаковую специфичность рестриктазы стали назвать изошимеразами. Ниже
приведены названия некоторых широко используемых рестриктаз и обозначения
соответствующих сайтов рестрикции:
Рестриктаза
Alul
Bam HI
EcoRI
Eco RII
Hind III
Hpal
Sau ЗА
Сайт рестрикции
Al
В
E
E2
HIII
HI
s3
В последнее время среди рестриктаз типа II открыты ферменты, распознающие
непалиндромные; структуры и расщепляющие ДНК на строго фиксированном расстоянии от
участка узнавания с образованием как тупых, так и «липких концов». Их относят к
подклассу IIS (от англ. shift - перестановка, сдвиг). Из них особенно интересны те, которые
образуют достаточно длинные «липкие концы». В каждом месте гидролиза изучаемой
молекулы ДНК такие «липкие концы» имеют уникальную последовательность. Это
позволяет направленно объединять образованные этими рестриктазами фрагменты с
восстановлением исходной структуры ДНК, как например, это было сделано в отношении
фага Л с использованием рестриктазы Нра 1. Еще один фермент этого подкласса - Bbv (из
Bacillus brevis) - узнает в ДНК последовательность, имеющую структуру
GCAGC (N)8
CGTCG (N)12
и расщепляет ДНК по одной из цепей на расстоянии 8 нуклеотидов от сайта
узнавания, а по другой цепи - на расстоянии 12 нуклеотидов от узнаваемого участка.
Рестриктазы типа III сходны с ферментами типа I. Для проявления активности они
нуждаются в АТР, Mg" и S-аденозилметионине. Эти рестриктазы состоят из 2 типов
субъединиц (рестриктазы и метилазы). Они узнают непалиндромные последовательности
длиной 5-6 н.п. и расщепляют ДНК в стороне от сайтов узнавания на расстоянии 24-25 н.п.
Исчерпывающего гидролиза ДНК они не производят.
Кроме бактерий рестриктазы выявлены у дрожжей Sachramyces serevisiae и
одноклеточных водорослей Chlamydomonas reinhardtii и по свойствам напоминают
рестриктазы типа III. У водорослей рестриктаза Сге I выявлена только в зиготах активна в
отношении только хлоропластической ДНК одного из парнеров. В генетической инженерии
рестриктазы (особенно типа II) используют для получения библиотек,. или банков геномной
ДНК. При обработке хромосомной ДНК рестриктазами (метод дробовика - «shopgun»)
получают огромное количество фрагментов ДНК (10 5 -10 7 фрагментов из генома
млекопитающих). Далее путем использования плазмид и их клонирования получают
миллионы колоний клеток бактерий или дрожжей, каждая из которых содержит плазмиду с
различными фрагментами ДНК. Это и есть библиотека, или банк геномной ДНК.
Соответствующий банк был использован и при изучении структуры генома человека.
Ниже приведены сведения о других фрагментах, используемых в различных методах
генетической инженерии.
ДЫК-лигаза представляет собой еще один важнейший инструмент, способный
катализировать синтез фосфодиэфирной связи в двуцепочечной ДНК. Наиболее, часто в
генетической инженерии используется ДНК-лигаза фага Т4, способная в присутствии АТР
сшивать фрагменты ДНК как с липкими, так и тупыми концами. Это фермент состоит из
одной полипептидной цепи (68 кДа) и ускоряет синтез фосфодиэфирной связи между 5'фосфатным (5'-р) и З'-гидроксильными концами (З'-ОН) цепей ДНК. При лигировании
липких концов реакция идет по схема
5' -------------------- pG-OHpA ------------------------ 3'
у ------------------------------------- pAHO-Gp -------- 5'
ДНК-лигаза ↓
АТР, Mg2'
5' ---------------------pG-OHpA-...... ------------------ 3'
3' -------------------------------------рA HO-Gp ------- 5'
Частым случаем данной реакции является лигирование так называемого ника разрыва в одной из цепей ДНК№
ДНК-полимераза E.coli была открыта А. Корнбергом и соавт. в 1958 г. Этот фермент,
называемый в настоящее
время
ДНК-полимеразой
I,
состоит
из
одной
полипептидной цепи (103 кДа) и имеет трехдоменную структуру. Каждый домен
обладает определенной ферментативной активностью: N-концевой домен 5'→3' экзонуклеазной; С-концевой домен 5'→3' - полимеразной (нуклеотидилтрансферазной); а
среди домен 5'→3' - экзонуклеазной. N-концевой домен может быть отщеплен с
использованием протеаз (трипсином, субтилизином и др.); остающаяся часть молекулы (68
кДа) - фрагмент Кленова - сохраняет присущие ей каталитические активности.
За счет 5'→3' - нуклеазной активности ДНК-полимераза I способна отщеплять
нуклеотиды с 5'-конца одной цепи ДНК (в спаренных участках), что происходит в месте
разрыва (ника). При этом одновременно идут две реакции: 5'→3' - экзонуклеазный
гидролиз и 5'→3' - полимеразная реакция. В этом случае происходит процесс «переноса»
одноцепочечного разрыва вдоль цепи ДНК- ник-трансляция: Удаление —> Гидролиз —>
5'
↓↓↓
3'
3' ------------------------------------ рA HO-Gp—- ... -5'
ДНК-полимераза I ↓
5' -------------------------------------------- 3
3' ------------------------------------ ---------------------5'
Если использовать в приведенной реакции радиоактивные нуклеотиды, то можно
получать меченую ДНК.
Разрыв
(ник)
обычно
проводят,
добавляя
к
препарату
ДНК
следовые
количества эндодезоксирибонуклеазы (ДНКазы I из
поджелудочной железы быка), добиваясь исходной бреши в цепи,. необходимой для
присоединения фермента и запуска ник-трансляции. Эта реакция in vivo играет важную роль
в репарации поврежденной ДНК.
Нуклеазы, специфичные в отношении одноцепочечной ДНК, выделены из разных
объектов: плесневого гриба Aspergillus ovyzae, Neuropora и др. Нуклеаза SI, выделенная из A
.oryzae, используется в генетической инженерии для удаления шпильки (одноцепочечного
участка) ДНК при получении кДНК с помощью обратной транскриптазы.
РНКазы Н специфически расщепляют цепь РНК в дуплексе РНК:ДНК. РНКаза Н E.coli
представляет собой эндорибонуклеазу, продуктами действия которой являются
олигорибонуклеотиды. Она широко используется в ряде приемов (стратегий) генетической
инженерии. Клетки эукариот также содержат эндонуклеазу такого типа. Эндонуклеазная
активность РНКазы Н свойственна и обратным транскриптазам ретровирусов.
Обратная транскриптаза (ревертаза). В 1964 г. Г. Темин выдвинул гипотезу о
существовании специфических для РНК-содержащих ретровирусов ферментов, способных
синтезировать ДНК на матрице РНК, а в 1970 г.Г. Темин и С. Мизутани, а также независимо
от них Д. Балтимор открыли этот фермент у вируса саркомы Рауса. Эта РНК-зависим^ая
ДНК-полимераза получила название обратная транскриптаза, или ревертаза. Наиболее
изучена ревертаза вирусов птиц, которая состоит из 2 субъединиц - а (65 кДа) и |3 (95 кДа) и
обладает по крайней мере тремя активностями: ДНК-полимеразной (может использовать в
качестве матрицы как РНК, так и ДНК); активностью РНКазы Н (гидролизует РНК в составе
гибрида РНК:ДНК, но атакует свободную РНК); ДНК-эндонуклеазной активностью. Первые
две активности, используются для синтеза ДНК, комплементарной вирусной РНК, которая
затем интегрируется в генном клетки-хозяина. Эндонуклеазная активность, очевидно,
используется для внесения разрыва в цепи ДНК-хозяина. Показано, что β-субъединицы
данной ревертазы обладают всеми тремя активностями, α -субъединица - только
активностями ДНК-полимеразы и РНКазы. Затравкой (праймером) для полимеразной
реакции могут служить небольшие участки одноцепочечных молекул ДНК или РНК (а
также тРНК).
В генетической инженерии ревертаза очень широко используется для
целенаправленного синтеза на матричных РНК комплементарных молекул ДНК (кДНК). Для
повышения эффективности этой процедуры дополнительно применяются и другие
ферменты.
Если включить полученную таким образом кДНК в быстрореплицирующиеся
генетические элементы (плазмиды), то в них можно вырастить клоны кДНК. С
использованием различных мРНК таким способом получают библиотеки кДНК. Библиотека
кДНК отличается от библиотеки геномной ДНК, которую получают после обработки ДНК
рестриктазами. В библиотеке геномной ДНК содержатся миллионы клонов - колоний, в
которых не обязательно присутствуют дискретные гены, так как рестриктазы разрезают ДНК
и внутри генов. Обратная транскриптаза дает возможность получить более прогрессивную
библиотеку транскрибируемых генов, в которой нетрудно идентифицировать клон, если ген
кодирует определенный белок, по которому (биохимическими методами) и
идентифицируют клон. ДНК в таких библиотеках не содержит интронов, и по ней легко
определить аминокислотную последовательность белка, как сейчас нередко и поступают,
определяя структуру белков, не имея их препаратов.
Нуклеаза Bal 31, выделяемая из псевдомонады Alteromonas espejiana, способна как
экзонуклеаза-удалять мононуклеотиды одновременно 5'- и 3' - концов двуцепочечной ДНК,
а также действовать как эндонуклеаза, специфичная к одноцепочечной ДНК. Таким
образом, этот фермент позволяет «подтупить» несимметричные концы ДНК либо укоротить
фрагменты ДНК, чтобы сблизить их функционально значимые элементы, а затем
объединить их с помощью ДНК-лигазы.
Концевая (терминальная) дезоксинуклеотидилтрансфераза из тимуса теленка
наращивает нуклеотиды 3' - ОН-конец одно- или двуцепочечной молекулы ДНК. С ее
помощью можно «подтупить» концы ДНК (если 3' - ОН-конец короче). Используя этот
фермент, к фрагментам ДНК можно присоединять (наращивать) олигонуклеотидные
«хвосты», состоящие из одного вида нуклеотидов. Если к другому фрагменту ДНК
присоединить комплементарный ему другой хвост (конец), то они могут гибридизоваться и
образовывать гибридные (рекомбинантные) молекулы ДНК.
Именно этот фермент и был использован в 1972 г. при получении первых гибридных
ДНК. Кроме этого с его помощью можно вводить радиоактивные нуклеотиды в 3' - конец
ДНК.
Поли (А)-полимераза E.coli катализирует присоединение к свободному 3' - концу
одноцепочечной РНК Поли (А)-последовательности. Этот фермент используется при
подготовке молекул РНК. не содержащих Поли (А)-хвоста, для синтеза на них кДНК с
помощью ревертазы. Он может быть использован; также для введения радиоактивной метки
в 3' - конец РНК.
Полинуклеотидилкиназа была выделена из E.coli, инфицированной бактериофагом Т4.
Фермент кодируется геномом бактериофага и переносит фосфорные остатки на 5' концевые гидроксильные группы молекул ДНК и РНК, используя в качестве донора
фосфата АТР. Этот фермент применяют для мечения 5' -конца полинуклеотидной цепи с
помощью радиоактивного Р, содержащегося в АТР, меченной по у-фосфату. Содержащийся
в исходной молекуле немеченый 5' - фосфат предварительно удаляют с помощью другого
фермента - фосфомоноэстразы (фосфатазы).
Литература:
1. Молекулярная биология. Учебное пособие для студентов медицинских вузов Автор:
Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Изд-во: Медицинское информационное агентство,
2007. С. 536
2. Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред.
А.С.Спирина. М.: Академия, 2011.
3. Бокуть С.В., Герасимович Н.В., Милютин А.А. Название: Молекулярная биология,
изд-во:Вышэйшая школа, Год: 2005
Вопросы для самоконтроля:
Рестрикция ДНК
Неделя 15
Кредит час 29
Лекция № 15
Тема: Достижения и перспективы генетической инженерии.
Цель: изучить достижения и перспективы генетической инженерии.
Содержание лекции:
Получение биологически активных соединений. Генетическая инженерия не только
открыла возможности для конструирования генов, но и легла в основу новых
альтернативных технологий получения биологически активных соединений (гормонов
рилизинг факторов, регуляторных пептидов, интерферонов и т.д.). Многие из этих
соединений содержаться в биологических объектах в ничтожных количествах, и их
препаративное выделение традиционными биохимическими методами оказывается слишком
трудоемким, а иногда и невозможным. Методы генетической инженерии позволяют
преодолеть эти трудности путем амплификации соответствующих генов, их клонирования и
экспрессии в клетках бактерий, дрожжей и. быстро реплицирующихся клетках
многоклеточных организмов и таким образом добиться получения значительных количеств
физиологически активных молекул, пригодных для лабораторного использования в качестве
медицинских препаратов, пищевых продуктов и т.д. В качестве примеров лабораторного
использования методов генетической инженерии остановимся на генно-инженерных
способах получения пептидных гормонов и интерферонов.
Одним из первых методами генетической инженерии был получен гормон роста
человека -соматотропный гормон (HGH). В организме он синтезируется клетками гипофиза.
Этот гормон состоит из 121 аминокислотного остатка, его мол. масса составляет 20 кДа.
Отправной точкой для получения гормона роста являлось выделение соответствующей
мРНК
из
клеток
гипофиза.
Далее
осуществляли
синтез
кДНК,
из которой в дальнейшем выщепляли область, кодирующую сигнальный пептид, а вместо
нее встраивали триплет ATG, который кодирует аминокислоту метионин и служит сигналом
начала трансляции в белоксинтезирующей системе клеток. К полученному таким образом
гену присоединяли необходимые для его эффективной экспрессии регуляторные элементы
(промотор и лидерную последовательность, служащую для прикрепления мРНК к рибосоме)
и затем включали
всю эту конструкцию в соответствующую плазмиду.
получая таким образом вектор молекулярного клонирования. Дальнейшая трансформация и
клонирование этого вектора в бактериальных клетках, где осуществляется интенсивная
репликация, транскрипция и трансляция, позволяет получить необходимое количество
гормона,
который
затем
используют
не
только
в
медицинских целях, но и в практическом животноводстве, повышая с его помощью
интенсивность роста, животных.
Получение соматостатина представляет собой интересный пример целенаправленного
конструирования белков, выполняемого с помощью методов генетической инженерии.
Соматостатин представляет собой короткий пептид (содержит 14 аминокислотных
остатков), который синтезируется в желудочно-кишечном тракте и тормозит
высвобождение из гипофиза гормона роста. Получить соматостатин в клетках бактерий в
значительных количествах первое время не удавалось, так как он быстро разрушался
протеолитическими ферментами. Чтобы «обмануть» внутриклеточные бактериальные
протеазы, пришлось сконструировать химерный белок - искусственный предшественник
соматостатина. В этом белке в качестве N-концевого участка использовали легко
синтезируемый белок бактерии, а к нему через аминокислоту-связку присоединили сам
соматостатин. Все это было сделано на уровне генетического материала (ДНК), который
затем клонировали в соответствующем векторе. Для синтеза соматостатина его ген был
получен методом химического синтеза, а потом совмещен с бактериальным геном ргалактозидазы, к которому дополнительно подстроили фрагмент бактериального оперона,
содержащий промотор и оператор. В качестве связывающего элемента в этой конструкции
был использован триплет ATG. Будучи трансформирован в составе плазмидного вектора в
бактериальные клетки, этот ген служил источником для синтеза в них химерного белка,
содержащего последовательности Р-галактозидазы и соматостатина, соединенные через
остаток метионина. После выделения из клеток бактерии этот белок обрабатывали
бромцианом, в результате чего происходило его расщепление по остаткам метионина и
таким образом достигалось вычленение из его состава физиологически активного пептида соматостатина. Успех работы обеспечивался предварительным анализом первичной
структуры соматостатина, в составе которого отсутствуют остатки метионина.
Особое значение для практической медицины имел генно-инженерный синтез
инсулина, от недостатка которого, приводящего к диабету, повсеместно страдает огромное
количество людей. Инсулин, строение которого подробно освещено в гл. 2, синтезируется в
поджелудочной железе в форме одноцепочечного белка-предшественника - препроинсулина.
Препроинсулин содержит сигнальный пептид, аминокислотные последовательности А и В,
соответствующие полипептидным цепях зрелого гормона, а, также соединительный пептид
С. В клетках поджелудочной железы после синтеза белка-предшественника сигнальный
пептид отщепляется и образуется проинсулин - молекула, в которой сохраняется
соединительный пептид С, необходимый для правильной ориентации А- и В-цепей гормона.
После образования двух дисульфидных мостиков между цепями А и В удаляется пептид С и
образуется зрелая молекула инсулина, обладающая гормональными свойствами. Инсулин
можно выделять из животных (свиней и телят), но некоторые люди испытывают аллергию к
его препаратам, полученным из животных, да и сами возможности выделения и очистки
гормона не беспредельны.
В 1978 г. в США путем химического синтеза были получены гены, кодирующие
аминокислотные последовательности зрелого гормона, и далее осуществлено их
клонирование в клетках E.coli. Однако выход биологически активного гормона был
незначителен, вероятно, в связи с отсутствием С-пептида, без которого плохо проходило
образование -S-S-.
Литература:
1. Молекулярная биология: Структура рибосом и биосинтез белка / Под ред.
А.С.Спирина. М.: Высшая школа, 1986.
2. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. М.: Высшая
школа, 1996.
Вопросы для самоконтроля:
Достижения и перспективы генетической инженерии.
6. ПЛАН ЛАБОРАТОРНЫХ ЗАНЯТИЙ
№
Тема
Содержание лабораторного занятия
1
Компоненты
нуклеиновых кислот.
1.Понятие гена и генетической
информации
в
молекулярной
биологии.
Генетическая
роль
нуклеиновых кислот.
2.Структура ДНК. Модель УотсонаКрика.
Доказательство
двухспиральной структуры ДНК.
Современное
представления
о
молекулярных
механизмах
репликации ДНК.
3.Общий
механизм
и
стадии
транскрипции,
участники
этого
процесса.
Современные
представления
о
механизмах
транскрипции.
Регуляция
транскрипции.
4.Процессинг
первичных
транскриптов.
Процессинг
и
созревания мРНК у эукариот.
Сплайсинг. Транскрипция гена в
митохондриях.
2
Репликация ДНК.
1.Типы репликации ДНК.
2.Ключевые ферменты репликации
ДНК (ДНК-полмеразы, ДНК-лигазы)
Неде
ля
1
2
Литература
1.Уотсон Дж. Молекулярная биология гена М.: Мир, 1978
2.Молекулярная биология: Структура и биосинтез
нуклеиновых кислот (под. ред. Спирина А.С.).-М.:
Высшая школа, 1990
3.Молекулярная биология: Структура рибосом и
биосинтез белка (под. ред. Спирина А.С.).-М.: Высшая
школа, 1996
4.Степанов В.М.. Молекулярная биология. Структура и
функции белков. М.: Высшая школа, 1996
5.Альбертис Б., Брейм Д., Льюис Дж., Рефф М., Робертис
К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки в 5-и
томах. – М.: Мир, 1994
6.Сингер М., Берг П. Гены и неомы. В 2-х томах. - М.:
Мир, 1994
7.Уотсон Дж., Туз Дж., Кури Д. Рекомбинантные ДНК.
М.: Мир, 1986
8.Льюин Б. Гены. М.: Мир, 1987
9.Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология в 3-х
томах. М.: Мир, 1982
10.
Эллиот В., Эллиот Д. Биохимия и молекулярная
биология. –М.: НИИ Биомедицинской химии РАМН,
2000
Молекулярная биология. Учебное пособие для студентов
медицинских вузов Автор: Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов
С.Л. Изд-во: Медицинское информационное агентство,
2007. С. 536
Молекулярная биология: Структура и биосинтез
нуклеиновых кислот/ Под ред. А.С.Спирина. М.:
Академия, 2011.
Бокуть С.В., Герасимович Н.В., Милютин А.А. Название:
Молекулярная биология, изд-во:Вышэйшая школа, Год:
2005
3
Транскрипция.
1.Строение информационных РНК.
2.Синтез РНК.
3.Структура промоторов.
4.Терминация.
3
4
РНК.
1.Созревание транспортных РНК.
2.Механизмы сплайсинга РНК.
3.Гетерогенная ядерная РНК.
4
5
Получение
раствора
растительного белка и
изучение его свойств.
Выделение и изучение
свойств
дезоксирибонуклеопроте
идов.
1. Получение раствора растительного
5
6
7
Структура
эукариотических
геномов.
белка и изучение его свойств.
1. Выделениедезоксирибонуклеопротеи
Сингер М., Берг П. Гены и геномы. В 2-х томах. - М.:
Мир, 1994
1.Уотсон Дж. Молекулярная биология гена М.: Мир, 1978
2.Молекулярная биология: Структура и биосинтез
нуклеиновых кислот (под. ред. Спирина А.С.).-М.:
Высшая школа, 1990
3.Молекулярная биология: Структура рибосом и
биосинтез белка (под. ред. Спирина А.С.).-М.: Высшая
школа, 1996
4.Степанов В.М.. Молекулярная биология. Структура и
функции белков. М.: Высшая школа, 1996
1.Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология в 3-х
томах. М.: Мир, 1982
2.Эллиот В., Эллиот Д. Биохимия и молекулярная
биология. –М.: НИИ Биомедицинской химии РАМН,
2000
3.Молекулярная биология: Структура и биосинтез
нуклеиновых кислот (под. ред. Спирина А.С.).-М.:
Высшая школа, 1990
1. Сказкин, раб. 125
2. Викторов, раб. 43
6
1. Шапиро,
стр. 48
7
1. Степанов
дов.
2. Качественная реакция на ДНК.
3. Выделение нуклеотидов из дрожжей.
4. Гидролиз
нуклеопротеидов.
5. Очистка
и разделение нуклеиновых
кислот.
1.Гены, кодирующие белки.
2.Регуляторы
элементы
кодирующих белки
генов,
В.М.. Молекулярная биология. Структура и
функции белков. М.: Высшая школа, 1996
2. Альбертис Б., Брейм Д., Льюис Дж., Рефф М., Робертис
3.Рибосомные гены.
4.Гены тРНК и гистоновые гены.
8
Геном прокариот.
1.Структура
бактериальной
хромосомы.
2.Структура прокариотических генов.
3.Бактериальные плазмифы
4.IS-элементы
и
транспозоны
бактерий.
8
9
Типы
и
мутаций.
1. Причина
9
10
Репарация.
11
Концепция оперона.
причины
точечных мутаций (ошибка
репликации, не исправленные ДНКполимеразой).
2. Процессы
спонтанного
дезаминирования
оснований
процессы апуринизации.
3. Повреждения ДНК, под действием
химических факторов окружающей
среды.
4. Химический
канцерогенез
интеркаляция мутагенное действие
физических факторов.
1. Характеристика репараций.
2. Эксцизионная репарация.
3. Рекомбинантная репарация.
4. SOS-репарация.
1.
2.
3.
4.
Открытие регуляторного гена.
Контролирующая система оперона.
Характеристика lac-репрессора.
Контакты в операторе.
10
11
К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки в 5-и
томах. – М.: Мир, 1994
3. Сингер М., Берг П. Гены и неомы. В 2-х томах. - М.:
Мир, 1994
1. Уотсон Дж. Молекулярная биология гена М.: Мир, 1978
2. Молекулярная биология: Структура и биосинтез
нуклеиновых кислот (под. ред. Спирина А.С.).-М.:
Высшая школа, 1990
3. Молекулярная
биология: Структура рибосом и
биосинтез белка (под. ред. Спирина А.С.).-М.: Высшая
школа, 1996
1.Уотсон Дж. Молекулярная биология гена М.: Мир, 1978
2.Молекулярная биология: Структура и биосинтез
нуклеиновых кислот (под. ред. Спирина А.С.).-М.:
Высшая школа, 1990
3.Молекулярная биология: Структура рибосом и
биосинтез белка (под. ред. Спирина А.С.).-М.: Высшая
школа, 1996
4.С.Б. Бокуть, Н.В. Герасимович, А.А. Милютин
«Молекулярная биология» Минск «Высшая школа»
2005 г.
5.А.С. Коничев, Г.А. Севастьянова «Молекулярная
биология», М. 2005 г.
1. Степанов В.М.. Молекулярная биология. Структура и
функции белков. М.: Высшая школа, 1996
2. Альбертис Б., Брейм Д., Льюис Дж., Рефф М., Робертис
К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки в 5-и
томах. – М.: Мир, 1994
3. Сингер М., Берг П. Гены и неомы. В 2-х томах. - М.:
Мир, 1994
1.Уотсон Дж. Молекулярная биология гена М.: Мир, 1978
2.Молекулярная биология: Структура и биосинтез
нуклеиновых кислот (под. ред. Спирина А.С.).-М.:
Высшая школа, 1990
5. Парадокс индукции
репрессия.
катаболитная
12
Генетика прокариот.
1. Фенотипическая
изменчивость
прокариот.
2. Генотипическая
изменчивость
прокариот.
3. Значение мутаций.
4. Перспективы генной инженерии.
12
13
Вирусный концерогенез.
1. Культирование вирусов.
2. Вирусный канцерогенез.
3. Лечение и профилактика вирусных
инфекций.
4. Бактериофаги.
13
14
Гибридизация
нуклеиновых кислот.
1. Методы гибридизации.
2. Методы амплификации нуклеиновых
кислот.
3. Клонирование ДНК.
4. Определение
нуклеотидных
последовательностей.
14
15
Векторы, применяемые в 1. Плазмидные векторы.
генной инженерии.
2. Фаговые векторы.
3. Плазмидно- фаговые векторы.
15
3.Молекулярная биология: Структура рибосом и
биосинтез белка (под. ред. Спирина А.С.).-М.: Высшая
школа, 1996
1.Уотсон Дж. Молекулярная биология гена М.: Мир, 1978
2.Молекулярная биология: Структура и биосинтез
нуклеиновых кислот (под. ред. Спирина А.С.).-М.:
Высшая школа, 1990
3.К.А. Лукомская «Микробиология с основами
вирусологии».
4.М.В. Гусев, Л.А. Минеева «Микробиология»
1.Уотсон Дж. Молекулярная биология гена М.: Мир, 1978
2.Молекулярная биология: Структура и биосинтез
нуклеиновых кислот (под. ред. Спирина А.С.).-М.:
Высшая школа, 1990
3.К.А. Лукомская «Микробиология с основами
вирусологии».
4.М.В. Гусев, Л.А. Минеева «Микробиология»
1.Уотсон Дж. Молекулярная биология гена М.: Мир, 1978
2.Молекулярная биология: Структура и биосинтез
нуклеиновых кислот (под. ред. Спирина А.С.).-М.:
Высшая школа, 1990
3.К.А. Лукомская «Микробиология с основами
вирусологии».
4.М.В. Гусев, Л.А. Минеева «Микробиология»
Молекулярная биология. Учебное пособие для студентов
медицинских вузов Автор: Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов
С.Л. Изд-во: Медицинское информационное агентство,
2007. С. 536
Молекулярная биология: Структура и биосинтез
нуклеиновых кислот/ Под ред. А.С.Спирина. М.:
Академия, 2011.
Бокуть С.В., Герасимович Н.В., Милютин А.А. Название:
Молекулярная биология, изд-во:Вышэйшая школа, Год:
2005
М.В. Гусев, Л.А. Минеева «Микробиология»
7.Методические указания по проведению СРСП (самостоятельная работа студентов с
преподавателями)
Тема СРСП: Определение репликации.
Цель занятия: Изучить процесс репликации.
Форма проведения: Доклад письменного конспекта (минидоклад)
Задания, вопросы: Составить вопросы др.студентам по теме.
Методические рекомендации, раздаточный материал: Оформить письменный
конспект по вопросам и выступить на СРСП, с использованием схем, согласно плану.
Ответить на тестовые задания.
Литература: согласно плану (см. основную и дополнительную литературу)
Тема СРСП: Основной фермент репликации и его свойства
Цель занятия: Изучить основной фермент репликации и его свойства
Форма проведения: диспут
Методические рекомендации, раздаточный материал: Организовать развернутый
диспут, который должен основываться на материале найденном студентом по данной
теме
Литература: согласно плану (см. основную и дополнительную литературу)
Тема СРСП: Белки и ферменты репликации.
Цель занятия: Изучить основные белки и ферменты репликации
Форма проведения: минидоклад
Задания, вопросы: Составить вопросы др.студентам по теме.
Методические рекомендации, раздаточный материал: Писменный конспект по
вопросам и выступить на СРСП, с использованием схем, согласно плану. Ответить на
тестовые задания.
Литература: согласно плану (см. основную и дополнительную литературу)
Тема СРСП: Последовательность событий репликации.
Цель занятия: Изучить последовательность событий репликации
Форма проведения: Составить писменный конспект (минидоклад)
Задания, вопросы: Составить вопросы др.студентам по теме.
Методические рекомендации, раздаточный материал: Писменный конспект по
вопросам и выступить на СРСП, с использованием схем, согласно плану. Ответить на
тестовые задания.
Литература: согласно плану (см. основную и дополнительную литературу)
Тема СРСП: Отличие репликации у прокариот и эукариот.
Цель занятия: Изучить отличия репликации у прокариот и эукариот
Форма проведения: выступление с устным сообщением
Задания, вопросы:
Чем отличается репликация у прокариолт и эукариот.
Методические рекомендации, раздаточный материал: устное сообщение
Литература: согласно плану (см. основную и дополнительную литературу)
Тема СРСП: Два механизма репликации.
Цель занятия: Изучить процессы механизма репликации ДНК
Форма проведения: проверка конспектов
Задания, вопросы:
Полуконсервативная теория репликации молекулы ДНК.
Методические рекомендации, раздаточный материал: Составить писменный конспект
по вопросам и выступить на СРСП, с использованием схем, согласно плану. Ответить на
тестовые задания.
Литература: согласно плану (см. основную и дополнительную литературу)
Тема СРСП: Исправление ошибок при репликации.
Цель занятия: Изучить процесс исправления ошибок при репликации
Форма проведения: Составить писменный конспект (минидоклад)
Задания, вопросы: Составить вопросы др.студентам по теме.
Методические рекомендации, раздаточный материал: Писменный конспект по
вопросам и выступить на СРСП, с использованием схем, согласно плану. Ответить на
тестовые задания.
Литература: согласно плану (см. основную и дополнительную литературу)
Тема СРСП: Определение транскрипции.
Цель занятия: Изучить процесс транскрипции
Форма проведения: проверка и оценивание схем.
Задания, вопросы: Как происходит процесс транскрипции у эукариот (механизм).
Методические рекомендации, раздаточный материал: Оформить схему транскрипции
в тетради.
Литература: согласно плану (см. основную и дополнительную литературу)
Тема СРСП: Сходство и отличия транскрипции и репликации.
Цель занятия: Изучить сходства и отличия транскрипции и репликации
Форма проведения: демонстрация презентации.
Задания, вопросы: В чем сходство и отличие транскрипции и репликации.
Методические рекомендации, раздаточный материал: демонстрация презентации.
Литература: согласно плану (см. основную и дополнительную литературу)
Тема СРСП: Основной фермент транскрипции и его свойства
Цель занятия: Изучить основной фермент транскрипции и его свойства
Форма проведения: Составить писменный конспект (минидоклад)
Задания, вопросы: Составить вопросы др.студентам по теме.
Методические рекомендации, раздаточный материал: Писменный конспект по
вопросам и выступить на СРСП, с использованием схем, согласно плану. Ответить на
тестовые задания.
Литература: согласно плану (см. основную и дополнительную литературу)
Тема СРСП: Этапы транскрипции: связывание РНК с ДНК; инициация; два этапа
терминации и транскрипции
Цель занятия: Изучить основные этапы транскрипции: связывание РНК с ДНК;
инициация; два этапа терминации и транскрипции
Форма проведения: Составить писменный конспект (минидоклад)
Задания, вопросы: Составить вопросы др.студентам по теме.
Методические рекомендации, раздаточный материал: Писменный конспект по
вопросам и выступить на СРСП, с использованием схем, согласно плану. Ответить на
тестовые задания.
Литература: согласно плану (см. основную и дополнительную литературу)
Тема СРСП: Основные этапы синтеза белка: активация аминокислот; инициация;
элонгация; транскрипция.
Цель занятия: Изучить основные этапы синтеза белка: активация аминокислот;
инициация; элонгация; транскрипция.
Форма проведения: Составить писменный конспект (минидоклад)
Задания, вопросы: Составить вопросы др.студентам по теме.
Методические рекомендации, раздаточный материал: Писменный конспект по
вопросам и выступить на СРСП, с использованием схем, согласно плану. Ответить на
тестовые задания.
Литература: согласно плану (см. основную и дополнительную литературу)
Тема СРСП: Ферменты транскрипции.
Цель занятия: Изучить ферменты транскрипции.
Форма проведения: Составить писменный конспект (минидоклад)
Задания, вопросы: Составить вопросы др.студентам по теме.
Методические рекомендации, раздаточный материал: Писменный конспект по
вопросам и выступить на СРСП, с использованием схем, согласно плану. Ответить на
тестовые задания.
Литература: согласно плану (см. основную и дополнительную литературу)
Тема СРСП: Ферменты транскрипции.
Цель занятия: Изучить ферменты транскрипции.
Форма проведения: Составить писменный конспект (минидоклад)
Задания, вопросы: Составить вопросы др.студентам по теме.
Методические рекомендации, раздаточный материал: Писменный конспект по
вопросам и выступить на СРСП, с использованием схем, согласно плану. Ответить на
тестовые задания.
Литература: согласно плану (см. основную и дополнительную литературу)
Тема СРСП: Определение мутации.
Цель занятия: Изучить процесс мутации.
Форма проведения: Составить писменный конспект (минидоклад)
Задания, вопросы: Составить вопросы др.студентам по теме.
Методические рекомендации, раздаточный материал: Писменный конспект по
вопросам и выступить на СРСП, с использованием схем, согласно плану. Ответить на
тестовые задания.
Литература: согласно плану (см. основную и дополнительную литературу)
Тема СРСП: Основные группы мутагенов
Цель занятия: Изучить основные группы мутагенов
Форма проведения: Составить писменный конспект (минидоклад)
Задания, вопросы: Составить вопросы др.студентам по теме.
Методические рекомендации, раздаточный материал: Писменный конспект по
вопросам и выступить на СРСП, с использованием схем, согласно плану. Ответить на
тестовые задания.
Литература: согласно плану (см. основную и дополнительную литературу)
Тема СРСП: Репарация мутаций
Цель занятия: Изучить репарации мутаций
Форма проведения: Составить писменный конспект (минидоклад)
Задания, вопросы: Составить вопросы др.студентам по теме.
Методические рекомендации, раздаточный материал: Писменный конспект по
вопросам и выступить на СРСП, с использованием схем, согласно плану. Ответить на
тестовые задания.
Литература: согласно плану (см. основную и дополнительную литературу)
Вопросы: Строение информационных РНК.
Синтез РНК.
Структура промоторов.
Терминация.
Тема СРСП: Классификация мутаций
Цель занятия: Изучить классификации мутаций
Форма проведения: Составить писменный конспект (минидоклад)
Задания, вопросы: Составить вопросы др.студентам по теме.
Методические рекомендации, раздаточный материал: Писменный конспект по
вопросам и выступить на СРСП, с использованием схем, согласно плану. Ответить на
тестовые задания.
Литература: согласно плану (см. основную и дополнительную литературу)
8.МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ И УКАЗАНИЯ ПО ТИПОВЫМ
РАСЧЕТАМ, ВЫПОЛНЕНИЮ РАСЧЕТНО-ГРАФИЧЕКИХ И
ЛАБОРАТОРНЫХ РАБОТ, КУРСОВЫХ
ПРОЕКТОВ
Название темы: Компоненты нуклеиновых кислот.
Цель занятия: Изучить основные компоненты нуклеиновых кислот.
Задания: Составить писменный конспект (минидоклад)
Методические рекомендации: Писменный конспект по вопросам, с использованием
схем, согласно плану. Ответить на основные вопросы.
Основные схемы, формулы: согласно плану
Вопросы: Понятие гена и генетической информации в молекулярной биологии.
Генетическая роль нуклеиновых кислот.
Структура ДНК. Модель Уотсона-Крика. Доказательство двухспиральной структуры
ДНК. Современное представления о молекулярных механизмах репликации ДНК.
Общий механизм и стадии транскрипции, участники этого процесса. Современные
представления о механизмах транскрипции. Регуляция транскрипции.
Процессинг первичных транскриптов. Процессинг и созревания мРНК у эукариот.
Сплайсинг. Транскрипция гена в митохондриях.
Название темы: Репликация ДНК
Цель занятия: Изучить основные процессы репликации ДНК
Задания: Подготовиться к защите материала устно.
Методические рекомендации: Составить развернутый писменный конспект по вопросам,
с использованием схем, согласно плану. Ответить на основные вопросы.
Основные схемы, формулы: согласно плану
Вопросы: Типы репликации ДНК.
Ключевые ферменты репликации ДНК (ДНК-полмеразы, ДНК-лигазы)
Название темы: Транскрипция.
Цель занятия: Изучить основные процессы транскрипции
Задания: Составить писменный конспект (минидоклад)
Методические рекомендации: Писменный конспект по вопросам, с использованием
схем, согласно плану. Ответить на основные вопросы.
Основные схемы, формулы: согласно плану
Название темы: РНК.
Цель занятия: Изучить основные процессы РНК.
Задания: Составить писменный конспект по теме.
Методические рекомендации: Писменный конспект по вопросам, с использованием
схем, согласно плану. Ответить на основные вопросы.
Основные схемы, формулы: согласно плану
Вопросы: Созревание транспортных РНК.
Механизмы сплайссинга РНК.
Гетерогенная ядерная РНК.
Название темы: Получение раствора растительного белка и изучение его свойств.
Цель занятия: Изучить процесс получения раствора растительного белка и изучить его
свойств.
Задания: Составить писменный конспект (минидоклад)
Методические рекомендации: Писменный конспект по вопросам, с использованием
схем, согласно плану. Ответить на основные вопросы.
Основные схемы, формулы: согласно плану
Вопросы: Получение раствора растительного белка и изучение его свойств.
Название темы: Выделение и изучение свойств дезоксирибонуклеопротеидов
Цель занятия: Изучить основные процессы выделеняе и изучить свойства
дезоксирибонуклеопротеидов
Задания: Составить писменный конспект (минидоклад)
Методические рекомендации: Писменный конспект по вопросам, с использованием
схем, согласно плану. Ответить на основные вопросы.
Основные схемы, формулы: согласно плану
Вопросы: Выделениедезоксирибонуклеопротеидов
Качественная реакция на ДНК.
Выделение нуклеотидов из дрожжей.
Гидролиз нуклеопротеидов.
Очистка и разделение нуклеиновых кислот.
Название темы: Структура эукариотических геномов
Цель занятия: Изучить основные структуры эукариотических геномов
Задания: Составить писменный конспект (минидоклад)
Методические рекомендации: Писменный конспект по вопросам, с использованием
схем, согласно плану. Ответить на основные вопросы.
Основные схемы, формулы: согласно плану
Вопросы: Гены, кодирующие белки.
Регуляторы элементы генов, кодирующих белки.
Рибосомные гены
Гены тРНК и гистоновые гены.
Название темы: Геном прокариот.
Цель занятия: Изучить геном прокариот.
Задания: Составить писменный конспект (минидоклад)
Методические рекомендации: Писменный конспект по вопросам, с использованием
схем, согласно плану. Ответить на основные вопросы.
Основные схемы, формулы: согласно плану
Вопросы: Структура бактериальной хромосомы.
Структура прокариотических генов.
Бактериальные плазмифы
IS-элементы и транспозоны бактерий.
Название темы: Типы и причины мутаций.
Цель занятия: Изучить основные типы и причины мутаций.
Задания: Составить писменный конспект (минидоклад)
Методические рекомендации: Писменный конспект по вопросам, с использованием
схем, согласно плану. Ответить на основные вопросы.
Основные схемы, формулы: согласно плану
Вопросы:
Причина точечных мутаций (ошибка репликации, не исправленные ДНК-полимеразой).
Химический канцерогенез интеркаляция мутагенное действие физических факторов.
Процессы спонтанного дезаминирования оснований процессы апуринизации.
Повреждения ДНК, под действием химических факторов окружающей среды
Название темы: Репарация.
Цель занятия: Изучить основные процессы репарации.
Задания: Составить писменный конспект (минидоклад)
Методические рекомендации: Писменный конспект по вопросам, с использованием
схем, согласно плану. Ответить на основные вопросы.
Основные схемы, формулы: согласно плану
Вопросы: Характеристика репараций.
SOS-репарация.
Эксцизионная репарация.
Рекомбинантная репарация.
Название темы: Концепция оперона.
Цель занятия: Изучить основные процессы концепции оперона.
Задания: Составить писменный конспект (минидоклад)
Методические рекомендации: Писменный конспект по вопросам, с использованием
схем, согласно плану. Ответить на основные вопросы.
Основные схемы, формулы: согласно плану
Вопросы: Открытие регуляторного гена.
Парадокс индукции катаболитная репрессия.
Контролирующая система оперона.
Характеристика lac-репрессора.
Контакты в операторе.
Название темы: Генетика прокариот.
Цель занятия: Изучить генетику прокариот.
Задания: Составить писменный конспект (минидоклад)
Методические рекомендации: Писменный конспект по вопросам, с использованием
схем, согласно плану. Ответить на основные вопросы.
Основные схемы, формулы: согласно плану
Вопросы: Фенотипическая изменчивость прокариот.
Генотипическая изменчивость прокариот.
Значение мутаций.
Перспективы генной инженерии.
Название темы: Вирусный концерогенез
Цель занятия: Изучить основные процессы вирусного концерогенеза
Задания: Составить писменный конспект (минидоклад)
Методические рекомендации: Писменный конспект по вопросам, с использованием
схем, согласно плану. Ответить на основные вопросы.
Основные схемы, формулы: согласно плану
Вопросы: Культивирование вирусов.
Вирусный канцерогенез.
Лечение и профилактика вирусных инфекций.
Бактериофаги.
Название темы: Гибридизация нуклеиновых кислот.
Цель занятия: Изучить основные процессы гибридизация нуклеиновых кислот
Задания: Составить писменный конспект (минидоклад)
Методические рекомендации: Писменный конспект по вопросам, с использованием
схем, согласно плану. Ответить на основные вопросы.
Основные схемы, формулы: согласно плану
Вопросы: Методы гибридизации.
Методы ампликации нуклеиновых кислот.
Клонирование ДНК.
Определение нуклеиновых последовательностей.
Название темы: Векторы, применяемые в генной инженерии.
Цель занятия: Изучить основные векторы, применяемые в генной инженерии.
Задания: Составить писменный конспект (минидоклад)
Методические рекомендации: Писменный конспект по вопросам, с использованием
схем, согласно плану. Ответить на основные вопросы.
Основные схемы, формулы: согласно плану
Вопросы: Плазмидные векторы.
Фаговые векторы.
Плазмидно – фаговые векторы.
8. МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ ОБУЧАЮЩЕГОСЯ.
Рекомендуется ответить на следующие вопросы.
• Как был доказан механизм репликации ДНК в ходе опытов Мезелсона и Сталя?
• Дайте характеристику реакции биосинтеза ДНК с участием ДНК-полимеразы. Какие
экспериментальные факты подтвердили ход данной реакций? Чем определяется
последовательность новосинтезированной ДНК?
• Какие эксперименты помогли установлению факта посредничества РНК при передаче
информации в системе ДНК-белок? Каковы три основных структурных различия между
ДНК и РНК?
• Как формулируется центральная догма молекулярной биологии? Насколько эта догма
абсолютна?
• Что понимается под адапторной РНК (предположение Ф. Крика)? Какова общая
структура и разнообразие адапторных РНК?
• Как получить препараты рРНК, мРНК и тРНК из определенного типа клеток на основе
различий их физико-химических свойств (количества, размера, сложности и ГЦсодержания)?
• Некоторые заболевания, вызывающие расстройство нервной системы, обусловлены
белками-прионами и распространяются с помощью белков, а не нуклеиновых кислот. Как,
опираясь на знания об экспериментах Эвери. МакЛеода и МакКарти, можно доказать в
данном случае отсутствие эффекта нуклеиновых кислот при переносе инфекции?
• Что такое репликация ДНК? В чем заключается биологический смысл и
медицинское значение репликации ДНК?
• Опишите репликативную вилку, дайте определения терминам «ведущая и
отстающие цепи», «праймер репликации», «фрагмент Оказаки». Покажите, в каком
направлении перемещается репликативная вилка и наращиваются цепи ДНК.
• Почему ДНК вируса SV-40 считается удобным модельным объектом для репликации?
• Какие инградиенты необходимы для ДНК-полимеразной реакций?
• Как выглядит ферментативный комплекс для репликации линейной ДНК?
• Каково значение образования временных ДНК-белковых комплексов ?
• Ученые-основоположники физиологического периода развития микробиологии:
• Первый микроскоп двояковыпуклых линз изобрел:
• Где впервые изобретен микроскоп?
• Кто ввел понятие клетка?
• Кто первый увидел микроорганизмы?
10. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ПРОХОЖДЕНИЮ УЧЕБНОЙ,
ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ И ПРЕДДИПЛОМНЫХ ПРАКТИК, ФОРМЫ
ОТЧЕТНОЙ ДОКУМЕНТАЦИИ
(программой не предусмотрено).
-
11.МАТЕРИАЛЫ ПО КОНТРОЛЮ И ОЦЕНКЕ УЧЕБНЫХ ДОСТИЖЕНИЙ
ОБУЧАЮЩИХСЯ
схема оценки знаний
письменные контрольные задания
тестовые задания
перечень вопросов для самоподготовки
экзаменационные билеты
Примеры контрольных работ
Контрольная работа № 1
(1-3) Верны ли следующие утверждения?
1
При электрофорезе в агарозном геле отдельные фрагменты ДНК мигрируют со
скоростью, обратно пропорциональной их молекулярной массе: чем крупнее молекулы,
тем сильнее они тормозятся сложной пространственной сеткой геля и тем медленнее
продвигаются от старта.
2
Ферменты, называемые рестриктазами, разрезают двуцепочечную спираль ДНК по
специфическим последовательностям, состоящим, как правило, из четырех-восьми
нуклеотидов, являющихся палиндромами.
3
Плазмидными векторами, используемыми при клонировании, могут быть
небольшие молекулы ДНК, которые содержат уникальные сайты рестрикции, чтобы
включить чужеродную ДНК, иметь свою точку начала репликации ДНК, а так же ген,
сообщающий клетке устойчивость к какому-либо антибиотику.
4
Расположите олигонуклеотиды по порядку возрастания температуры плавления:
АААTTGC
TTTAACG
GGG
CCC
GCGCGCG
CGCGCGC
AAAAAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTTTT
5
Расскажите о клонировании фрагментов генома, используя перечисленные
термины и по-возможности поясняя их значение

Выделение ДНК














Фрагментация ДНК
Рестриктаза
Вектор
Плазмида
Липкие концы
Гомологичное спаривание
Лигаза
Репортерные гены
Устойчивость к антибиотикам
Репортерный ген LacZ, β-галактозидаза, Х-Gal
Селективные среды
Клеточные клоны
Библиотека клонов
Определение первичной последовательности ДНК
Контрольная работа № 2
1. Место образования субъединиц рибосом, наблюдаемое в световой микроскоп,
называется ____________
2. ____________(у эукариот) и ______________(у прокариот) - последовательность
нуклеотидов ДНК, кодирующая один полипептид.
3. Ферменты, называемые ______________, присоединяют каждую аминокислоту к
соответствующей молекуле тРНК, образуя молекулу ________________.
4. Генетический код называют ______________, потому что большинство аминокислот
представлено более чем одним кодоном.
5. _____________ катализирует синтез РНК-копии на цепи ДНК в ходе процесса,
называемого _____________.
6. Субстратом для фермента_________________ являются
дезоксирибонуклеозидтрифосфаты.
7. Процесс транскрипции состоит из стадий: узнавание промотора, осуществляемое
_______________, образование первой диэфирной связи или ____________,
__________ и терминация.
8. Для узнавания промотора необходим -фактор, который диссоциирует после
______________.
9. _______ субъединица РНК-полимеразы обеспечивает прочное связывание с ДНК.
10. В ___________ имеются два участка связывания молекулы тРНК: ___________, или Ручасток, удерживающий молекулу тРНК, присоединенную к растущему концу
полипептидной цепи, и ______________ или А-участок, предназначенный для
удерживания молекулы тРНК, нагруженной аминокислотой.
11. Образование пептидной связи катализируется ферментом _________, каталитическая
активность которой управляется крупной молекулой рРНК, входящей в состав
________ субъединицы рибосомы.
12. Белки, называемые факторами __________, связываются со________-кодоном в Аучастке рибосомы, в результате чего пептидилтрансфераза гидролизует связь, которая
соединяет растущий пептид с молекулой тРНК.
13. Во всех прокариотических клетках первую аминокислоту, с которой начинается любая
белковая цепь, доставляет молекула особой _____________, узнающей кодон AUG
и несущей аминокислоту _____________.
(14-19) Верны ли утверждения:
14. Модифицированные нуклеотиды, особенно часто встречающиеся в молекулах тРНК,
образуются в результате ковалентной модификации стандартных нуклеотидов
перед их включением в РНК-транскрипты.
15. Каждый комплекс аминокислоты с тРНК активирован не для его присоединения, а для
присоединения очередной аминокислоты к растущей полипептидной цепи.
16. Главная функция большой субъединицы рибосомы - связывание мРНК и различных
тРНК; малая субъединица рибосомы катализирует образование пептидной связи.
17. Поскольку стартовым кодоном для начала синтеза белка является AUG, то метионин
обнаруживается только на N-концах полипептидных цепей белков.
18. В любом месте двойной спирали ДНК обычно только одна цепь ДНК используется как
матрица.
19. В клетках бактерий транскрипцию РНК всех классов осуществляет РНК-полимераза
одного типа, тогда как в клетках эукариот используются три разных типа РНКполимераз.
20. Схематически изобразите два противоположно направленных оперона E. coli и
транскрипты с этих оперонов. Обозначьте кодирующие цепи, матричные цепи, их
5’ и 3' концы.
21. Расскажите о регуляции Lac оперона E. Coli
22. Перечислите основные этапы экспрессии про- и эукариотических генов.
Примеры вопросов для коллоквиума

Принципы строения двойной спирали ДНК.

Структура промоторов у про- и эукариот

Аттенуация

Рекогниция. Аминоацилирование tРНК.

Редактирование РНК

Современная схема репликации ДНК E.coli

Свойства генетического кода

Субъединичный состав РНК-полимеразы E.coli.

Аттенуация

Центры рибосом E.coli.

Современная схема репликации ДНК E.coli

Процессинг мРНК

Секвенирование ДНК по Сэнгеру.

Рестриктазы. Примеры использования рестриктаз в различных мол. биол.
методах
«Схема оценки знаний по дисциплине»
Активность на лекции
Активность на
семинаре
(практическом
занятии)
Активность на
лабораторном занятии
Активность на занятии
СРСП
100
100
Выполнение заданий
СРС
Индивидуальные
задания
Письменные работы
и другие виды
контроля
Рубежный контроль
Промежуточная
аттестация (Р1, Р2)
Текущий контроль
Рейтинг допуска
100
Итоговый
контроль(экзамен)
Итого
1.
2.
3.
4.
5.
6.
балл за
работу
Критерий оценки
Кол-во
выполн
-х работ
Оценка
вида
15
15
100
15
100
15
100
15
6
100
100
2
100
100
2
Среднеарифметическая
сумма всех оценок
N
(Р1+Р2)/2
Текущий
контроль *0,6
100*0,4
Рейтинг
допуска +
итоговый
контроль
Вопросы для проведения контроля знаний студентов
Какие опыты устанавливают генетическую роль нуклеиновых кислот?
Какова структура ДНК и способы записи генетической информации в соответствии
с правилами Чаргаффа?
Дайте определение нуклеиновой кислоты. Из каких нуклеотидов состоят ДНК и
РНК?
Как образуется суперспирализованная форма ДНК и какие ферменты участвуют в
этом процессе?
Рассмотрите рентгеновский снимок молекулы ДНК. Как анализ этого изображения
повлиял на установление строение ДНК?
Как был доказан механизм репликации ДНК в ходе опытов Мезелсона и Сталя?
7. Дайте характеристику реакции биосинтеза ДНК с участием ДНК-полимеразы.
Какие
8. экспериментальные факты подтвердили ход данной реакций? Чем определяется
последовательность новосинтезированной ДНК?
9. Какие эксперименты помогли установлению факта посредничества РНК при
передаче информации в системе ДНК-белок? Каковы три основных структурных
различия между ДНК и РНК?
10. Как формулируется центральная догма молекулярной биологии? Насколько эта
догма абсолютна?
11. Что понимается под адапторной РНК (предположение Ф. Крика)? Какова общая
структура и разнообразие адапторных РНК?
12. Как получить препараты рРНК, мРНК и тРНК из определенного типа клеток на
основе различий их физико-химических свойств (количества, размера, сложности и
ГЦ-содержания)?
13. Некоторые заболевания, вызывающие расстройство нервной системы,
обусловлены белками- прионами и распространяются с помощью белков, а не
нуклеиновых кислот. Как, опираясь на знания
об экспериментах
Эвери,
МакЛеода и МакКарти, можно доказать в данном случае отсутствие
эффекта нуклеиновых кислот при переносе инфекции?
14. Что такое репликация ДНК? В чем заключается биологический смысл и
медицинское значение репликации ДНК?
15. Опишите репликативную вилку, дайте определения терминам «ведущая и
отстающие цепи», «праймер репликации», «фрагмент Оказаки». Покажите, в каком
направлении перемещается репликативная вилка и наращиваются цепи ДНК.
16. Почему ДНК вируса SV-40 считается удобным модельным объектом для
репликации?
17. Какие инградиенты необходимы для ДНК-полимеразной реакций?
18. Как выглядит ферментативный комплекс для репликации линейной ДНК?
19. Каково значение образования временных ДНК-белковых комплексов ?
Вопросы к экзамену.
1. Определение предмета "молекулярная биология". Этапы развития. Основные
открытия.
2. Доказательства генетической роли нуклеиновых кислот.
3. Хронология открытий, подготовивших создание Уотсоном и Криком модели
двойной спирали ДНК.
4. Нуклеозид, нуклеотид, полинуклеотид. Нерегулярные полимеры.
5. Принципы строения двойной спирали ДНК. Виды ДНК.
6. Параметры В-, А- и Z-форм ДНК.
7. Виды РНК. Их роль в клетке.
8. Классификация аминокислот.
9. Первичная и вторичная структура белка.
10. Третичная и четвертичная структура белка.
11. Глобулярные и фибриллярные белки.
12. Денатурация и ренатурация белков.
13. Фолдинг белков. Шапероны. Шаперонины. Прионы.
14. Основные биологические функции белков.
15. Белки ферменты. Понятие о коферментах.
16. Белки трансформаторы энергии.
17. Регуляторная и рецепторная функции белков.
18. Транспортная, питательная и энергетическая функции белков.
19. Принципиальное строение биологической мембраны.
20. Функции ДНК. Информационная емкость.
21. Генетический код. Его основные свойства.
22. Принципы транскрипции.
23. Субъединичный состав РНК-полимеразы E.coli. Holo- и Core- фермент.
24. Понятие об опероне.
25. Особенности структуры промоторов у прокариот.
26. Этапы транскрипции у прокариот.
27. Регуляция транскрипции у бактерий.
28. Негативная индукция. Позитивная индукция.
29. Негативная репрессия. Позитивная репрессия.
30. Аттенуация в регуляции экспрессии триптофанового оперона E.coli.
31. Особенности транскрипции у эукариот.
32. Множественность и специфичность РНК-полимераз эукариот.
33. Понятие об экзонах и интронах .
34. Cis-элементы транскрипции. Понятие об энхансерах .
35. Trans-факторы транскрипции.
36. Образование инициаторного комплекса транскрипции с участием РНКполимеразы II.
37. Процессинг mРНК эукариот:
38. кепирование и полиаденилирование,
39. сплайсинг и редактирование.
40. Различные механизмы сплайсинга.
41. Автосплайсинг.
42. Trans-сплайсинг.
43. Альтернативный сплайсинг.
44. РНК-интерференция.
45. Структура tРНК.
46. Рекогниция. Аминоацилирование tРНК.
47. Структура рибосом про- и эукариот. Центры рибосом E.coli.
48. Образование инициаторного комплекса трансляции у прокариот.
49. Этапы трансляции у прокариот. Белковые факторы трансляции.
50. Регуляция трансляции на примере фага MS2.
51. Образование rРНК и белков рибосом у E.coli.
52. Образование рибосом у эукариот. Понятие о ядрышке.
53. Принципы репликации ДНК.
54. Доказательство полуконсервативного характера репликации.
55. Ферментативная система синтеза ДНК in vitro. Активирование ДНК.
56. ДНК-полимераза I из E.coli. Роль 3'5' и 5'3' гидролитических активностей.
57. Схема непрерывной антипараллельной репликации Корнберга.
58. Схема непрерывной параллельной репликации Кэрнса.
59. Схема прерывистой антипараллельной репликации Оказаки.
60. Сравнительная характеристика ДНК-полимераз I, II и III(core) из E.coli.
61. ДНК-полимераза III*, holo-фермент. Их функции.
62. Модель «катящегося колеса».
63. Праймаза и праймосома.
64. Проблема денатурации матрицы при репликации ДНК . SSB белки. Геликазы.
65. Принципы работы и биологические функции топоизомераз.
66. Современная схема репликации ДНК E.coli .
67. Репликация митохондриальной ДНК млекопитающих.
68. Особенности репликации ядерных ДНК эукариот. Полирепликонность.
69. Проблема недорепликации 3'-концов линейных молекул.
70. Теломеры и теломераза .
71. Основные репарабельные повреждения в ДНК и принципы их исправления.
72. Общая характеристика гистонов.
73. Нуклеосомный, супербидный, петлевой уровни компактизации ДНК эукариот.
Метафазная хромосома.
74. Геномы и кариотипы. Размеры и количество генов у разных таксонов.
75. Гены "домашнего хозяйства" и гены "роскоши".
76. Основы метода ренатурации ДНК в изучении структуры генома эукариот.
77. Сателлитная ДНК. Особенности состава. Локализация в геноме.
Палиндромы.
Роль обращенных повторов в геноме.
78. Умеренные повторы в геноме. Уники.
79. Понятие о мобильных генетических элементах. Классификация мобильных
генетических элементов по механизму перемещения.
80. Эффекты встройки мобильных элементов. Значение мобильных элементов в
эволюции.
81. Этапы понимания молекулярных механизмов канцерогенеза.
Тесты:
Тема: «Генетическая роль нуклеиновых кислот»
1.
Мономерными звеньями ДНК и РНК являются:
а)
нуклеозиды
б)
нуклетиды +
в)пурины
г) пентозы
2.
В нуклеиновых кислот мономерные остатки связаны собой:
а)
водородными
б)
пептидными
в)
фосфодиэфирными связаны +
г)
N— гликозилными
связаны
З.Урацил - это:
а)
6-амино-2-оксипиримидин
б)
2-амино-6-оксипурин
в)
6-аминопурин
г)
2,6-оксипиримидин +
4.
Согласно правилам Чаргаффа содержание аденина в молекуле ДНК равно:
а)
содержанию тимина +
б)
содержанию цитозина
в)
содержанию гуанина
г)
содержанию урацила
5.
Сахар пентоза, входящая в состав РНК:
а)
глюкоза
б)
фосфотриоза
в)
рибоза +
г)
2-дезоксирибоза
6.
Согласно модели Уотсона и Крика длина витка спирали равна:
а)
0,34 нм
б)
3,4 нм -+
в)
10 нм
г)
100 нм
7.
Вторичная структура ДНК была установлена:
а)
Э. Чаргаффом
б)
Дж. Уотсоном и Ф. Криком +
в)
М. Уилкинсом
г)
М. Чейз
8.
К пуринам относятся:
а) цитозин и
урацил
б)тимин и
аденин
в)аденин и гуанин +
г) урацил и гуанин
9.
Прочная
химическая
связь
в
молекуле
ДНК
возникает
между:
а)нуклеотидами +
б)дезоксирибозами соседних нуклеотидов
в)остатками фосфорной кислоты и сахара соседних нуклетидов
г) азотистыми основами
10. В каком случае правильно названы все отличия и-РНК от ДНК?
а) одноцепочная, содержит дезоксирибозу, хранит информацию
б)двуцепочная, содержит рибозу, передает информацию
в) одноцепочная, содержит рибозу, передает информацию +
г) двуцепочная,
содержит
дезоксирибозу,
передает
информацию
Тема: «Репликация ДНК»
11. Экспериментально гипотеза полуконцервативного механизма репликации была
доказана:
а) М. Мезельсоном и Ф. Сталем
б) Дж. Тэйлером
в) Дж. Уотсоном
г) М Чейзом
12. Фермент, который, разрушая водородные связи между комплементарными
основаниями,
раскручивает
двойную цепь ДНК в процессе репликации, называется:
а) лигаза
б)ДНК-полимераза
в) хеликаза
г) праймаза
13. Репликация -это процесс:
а) синтез белка
б) синтеза и-РНК
в) самовоспроизведения ДНК
г) репарации повреждений
14. Комплементарное копирование матрицы в процессе репликации осуществляет
фермент:
а) ДНК-лигаза
б) ДНК-топоизмераза
в) РНК-затравка
г) ДНК-полимераза
15. Первый этап репликации
ДНК:
а) элонгация
б)инициация
в) терминация
г) активация
16. Стабилизация
расплетенной
сверхскрученной
структуры
ДНК
осуществляется
ферментом:
а) лигазой
б)праймазой
в) SSB-белком
г) ДНК-полимеразой
17. Фрагменты Оказаки сшиваются в одну ковалентно-непрерывную
цепь
ДНК:
а) ДНК-лигазой
б)праймазой
в) ДНК-полимеразой
г) хеликазой
18. Репликативная вилка образуется в
процессе:
а)инициации
б)трансляции
в) элонгации
г) терм и наци и
19. По способу «катящегося кольца» реплицируются:
а) РНК
б) ДНК эукариот
в) ДНК некоторых фаговб вирусовб митохондрий, плазмид
г) ДНК человека
20. Почему репликация ДНК происходит в направлении 5'-3'?
а) 5'-3' полимеразная активность ДНК - полимеразы сопряженна с 5'-3' экзонуклеазнои
активностью
б) ДНК - полимераза в направлении 5'-3' не проявляет экзонуклеазную активность
в) для проявления полимеразы необходима З'-ОН затравка
г) РНК - затравка синтезируется только в
направлении
5'-3'.
Тема: «Транскрипция»
21. Процесс
синтеза
иРНК
на
матрице
ДНК
называется:
а)репликация
б)транскриция +
в)трансляция
г) сплайсинг
22. Посредством, какого фермента идет синтез тРНК у эукариот:
а) РНК-полимерза- III +
б) ДНК-лигаза
в) ДНК - полимераза-1
г) РНК- полимераза-1
23. Строго определенный участок ДНК с которого начинается синтез РНК называется:
а) терминатор
б)промотр+
в)оперон
г) транскриптон
24. Участок
гена,
не
несущий
информацию
о
белке:
а) экзон
б)интрон +
в)оперон
г) транскриптон
;
25. Сплайсинг-это:
а) сшивание экзон, удаление интронов +
б) синтез ДНК
в) синтез белка
г) процесс восстановления поврежденных участков ДНК
26. Процесс транскрипции проходит в:
а) ядре +
б) цитоплазма
в) рибосомах
г) митохондриях
27. Посредством какого фактора РНК-полимераза узнает просмотор:
а) р-фактора
б)g-фактора
в) о-фактора +
г) р-фактора
28.
Совокупность биохимических реакций, в результате которых уменьшается
молекулярная
масса
РНКпредшественника с образованием зрелых молекул РНК:
а)транслокация
б)транкрипция
в) трансляция
г) процессинг +
29. Участок
гена,
который
несет
информацию
о
белке:
а)интрон
б) экзон +
в)транскрипт
г)терминатор
30. Участок ДНК между промотором и терминатором называется:
а) интрон
б)транскриптон +
в) экзон
г) р-фактор
31. Структура клеверного листа:
а) вторичная структура молекулы РНК +
б) первичная структура молекулы рРНК
в) вторичная структура молекулы вирусной РНК
г) третичная
структура
иРНК
Тема: «Трансляция»
32. Перевод информации с 4-буквенного алфавита нуклеиновых кислот на 20-ти
буквенный алфавит аминокислот:
а)транскрипция
б) трансляция +
в)терминация
г) сплайсинг
33. Структуру
«клеверного
листа»
имеет:
а)тРНК +
б)рРН
в)иРН
г)мРНК
34. Синтез
белка
проходит
в:
а)рибосомах +
б) эндоплазматической сети
;
в) митохондриях
г) ядре
35.
Нонсенс кодоны. Укажите неверный ответ:
а)УАА
б)УАГ
в)УГА
г) АУГ +
36. Кодон,
с
которого
начинается
синтез
а)УУУ
б)УАГ
в) АУГ +
г) AAA
37. Процесс активации аминокислот является:
а) однофазным
б) двухфазным +
в) трехфазным
г) многофазным
Тема: «Генетический код»
38. Как читается генетический код:
а) через каждые два нуклеотида
б) группами по пять нуклеотидов
в) группами по три нуклеотида +
г) через одну нуклеотидную пару
39. Генетический код вырожден, потому что:
а) одной нуклеотидной паре соответствует 1 аминокислота
б) одной аминокислоте может соответствовать несколько кодонов +
в) одной аминокислоте соответствует два нуклеотида
г) он триплетен
40. Мутация, в результате которой делитируется один нуклеотид, приводит к:
а) перекрыванию нуклеотидов
б) сдвигу рамки считывания +
в) сдвигу одной аминокислоты и пиримидина
г) разрушению ДНК
белка:
12. Программное и мультимедийное сопровождение учебных занятий (в зависимости
от содержания дисциплины) ролики, слайды
13. Перечень специализированных аудиторий, кабинетов и лабораторий.
Корпус № 5 , аудитория № 32, 33