Murex HВsAg Подтверждающий анализ, версия 3

Murex HBsAg
Подтверждающий, версия 3
Тест-система для подтверждения наличия поверхностного антигена
вируса гепатита В в образцах сыворотки и плазмы
НАЗВАНИЕ
Murex HВsAg Подтверждающий анализ, версия
3
НАЗНАЧЕНИЕ
Murex HBsAg подтверждающий, версия 3
(GE37/2G27) представляет собой тест-систему
для подтверждения наличия поверхностного
антигена вируса гепатита В (HBsAg) в
сыворотке или плазме крови человека методом
иммуноферментного
анализа.
Система
предназначена
для
анализа
образцов,
реактивных в тесте Murex HBsAg, версия 3
(GE34/36, 9F80).
РЕЗЮМЕ И ОПИСАНИЕ ТЕСТА
Для подтверждения наличия HBsAg в повторно
реактивных
образцах
система
подтверждающего анализа Murex HBsAg
подтверждающий,
версия
3
использует
реакцию
нейтрализации
специфических
антител. В отличие от антител козы или мыши,
используемых
в
анализе
HBsAg,
специфические антитела, используемые в
подтверждающем тесте, получены от лошади,
что минимизирует риск подтверждения ложно
положительных образцов, содержащих антивидовые антитела.
ПРИНЦИПЫ ПРОЦЕДУРЫ
Для
каждого
тестируемого
образца
используются две лунки. Тест Murex HВsAg
проводится в соответствии с обычной
методикой
за
исключением
того,
что
разбавитель
образцов
заменяется
на
контрольный реагент в контрольной лунке и
специфический реагент в специфической
лунке. В процессе инкубации лошадиные антиHBs в специфическом реагенте конкурируют с
мышиными антителами, иммобилизованными
на лунках, за связывание с
HВsAg,
присутствующим в образце, что снижает
количество связанного с лунками HВsAg. В
контрольных лунках, где не происходило
конкурентного связывания, HВsAg связывается
с лунками как обычно. Затем добавляется
конъюгат, и анализ заканчивается как обычно.
В образцах, содержащих HВsAg, будет
наблюдаться существенная разница между
поглощением при 450 нм (А450) в контрольных и
специфических лунках. Если ингибирование в
специфических
лунках
превышает
50%,
образец
считается
подтвержденно
реактивным.
РЕАГЕНТЫ
ОПИСАНИЕ, ПОДГОТОВКА К ПРИМЕНЕНИЮ
И
РЕКОМЕНДОВАННЫЕ
УСЛОВИЯ
ХРАНЕНИЯ
См.
также
Предупреждения
предосторожности
и
Меры
1 Контрольный реагент
 1 флакон (1,25 мл) с окрашенным в желтый
цвет буфером, содержащим лошадиную,
козью,
человеческую (не реактивную на
HВsAg, антитела к вирусу гепатита С и
антитела к ВИЧ1/ВИЧ2) и бычью сыворотку и
детергенты. Содержит 0.05% консерванта
ProClin 300.

2 Специфический реагент
 1 флакон (1,25 мл) со специфическими
антителами лошади против HBsAg
в
окрашенном в красный цвет буфере,
содержащем
лошадиную,
козью,
человеческую (не реактивную на HВsAg,
антитела к вирусу гепатита С и антитела к
ВИЧ1/ВИЧ2)
и
бычью
сыворотку
и
детергенты. Содержит 0.05% консерванта
ProClin 300.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ
И МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
См. также вкладыш к тесту Murex HBsAg
version 3 (GE34/36, 9F80)
Для использования при диагностике in vitro.
Только для профессионального
использования.
ИНФОРМАЦИЯ
ЗДОРОВЬЯ
ПО
БЕЗОПАСНОСТИ
ДЛЯ
ВНИМАНИЕ:
Этот
продукт
содержит
полученные от человека и/или потенциально
инфекционные компоненты. Ни один из
известных методов тестирования не может
гарантировать того, что продукты, полученные
от
человека
или
содержащие
инактивированные
микроорганизмы,
не
являются переносчиками инфекции. Поэтому
все полученные от человека материалы
следует
считать
потенциально
инфекционными. С этими реагентами и
полученными
от
человека
образцами
рекомендуется обращаться в соответствии c
правилами GLP (good laboratory working
practice).
Отрицательная
сыворотка,
использовавшаяся для производства данных
реагентов была найдена отрицательной на
HВsAg и антитела к ВИЧ и к вирусу гепатита С.
2
Контрольный и специфический реагенты
содержат некоторое количество детергентов и
ProClin 300, которые считаются потенциально
опасными веществами. ProClin 300 может
абсорбироваться через кожу, и является
сенсибилизирующим агентом. Если какойнибудь из этих реагентов попадет на кожу или
в глаза, необходимо немедленно промыть
водой эти участки тела.
1. Аппаратура многократного использования
должна
стерилизоваться
после
использования.
Предпочтительным
методом является автоклавирование при
121оС в течение одного часа. Одноразовые
принадлежности
необходимо
автоклавировать или сжигать.
2. При разбрызгивании все капли образцов и
реагентов немедленно удалить с помощью
фильтровальной
бумаги,
а
контаминированную зону дезинфицировать
с помощью таких средств как 0,1 % раствор
гипохлорита
натрия,
или
других
подходящих дезинфицирующих средств.
Гипохлорит натрия нельзя использовать,
если в каплях находится кислота, сначала
капли надо вытереть досуха. Материалы,
использовавшиеся для деконтаминации,
включая
перчатки,
должны
утилизироваться безопасным способом.
Нельзя
автоклавировать
материалы,
содержащие гипохлорит натрия.
3. Нейтрализованные кислоты или другие
жидкие
отходы
должны
деконтаминироваться путем добавления
достаточного объема гипохлорита натрия,
чтобы
его
конечная
концентрация
составляла, по крайней мере, 1.0%.
Необходимо выдержать отходы в растворе
гипохлорита натрия 30 мин для достижения
эффективной деконтаминации.
4. Не набирать растворы пипеткой путем
всасывания ртом. Надевайте одноразовые
перчатки и защитные очки при работе с
образцами и проведении анализа. Хорошо
вымойте руки после работы.
5. Контрольный и специфический реагенты
содержат ProClin 300, который
может
абсорбироваться через кожу и является
сенсибилизирующим агентом. Если какойнибудь из этих реагентов попадет на кожу
или в глаза, необходимо немедленно
промыть водой эти участки тела.
6. Серная кислота, используемая в стоп
реагенте, и соляная кислота, используемая
для мытья стеклянной посуды, вызывают
коррозию,
и
с
ними
необходимо
обращаться
с
осторожностью.
При
попадании на кожу или глаза необходимо
промыть большим количеством воды.
Murex HВsAg Подтверждающий анализ, версия 3
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ПРИ АНАЛИЗЕ
1. Не используйте реагенты после даты
истечения срока годности. Избегайте
микробиологического
загрязнения
образцов,
поскольку
это
может
сократить срок годности реагентов и
привести к неправильным результатам.
2. Не модифицируйте процедуру анализа
и не заменяйте реагенты реагентами
других производителей или других
партий, за исключением случаев когда
такие
реагенты
обозначены
как
взаимозаменяемые.
3. Перед
использованием
доведите
температуру реагентов до комнатной
(18-30оС). Сразу после использования
верните
реагенты
в
место
рекомендованного хранения.
4. Любая
стеклянная
посуда,
используемая для реагентов, должна
быть промыта 2М соляной кислотой и
ополоснута
дистиллированной или
деионизованной
водой
высокого
качества.
5. Избегайте перекрестной контаминации
контролей,
образцов
и
других
реагентов
со
специфическим
реагентом.
6. Избегайте
использования
саморазмораживающихся
холодильников для хранения образцов
и реагентов.
7. Не оставляйте реагенты на сильном
свету и не подвергайте воздействию
паров соляной кислоты при хранении и
во время инкубации.
8. Не допускайте высыхания лунок в
процессе проведения анализа.
9. Убедитесь,
что
донышки
лунок
планшеты чистые и сухие, и на
поверхности жидкости в лунках нет
пузырьков
перед
проведением
фотометрического
считывания
планшета.
10. Избегайте загрязнения микролунок
пыльцой из одноразовых перчаток.
Нельзя использовать СО2 инкубатор.
11. Если
при
проведении
анализа
используются
автоматические
инструменты, требование применять
крышки
планшет
и
вытряхивать
содержимое лунок на фильтровальную
бумагу, может не выполняться.
12. Если в автоматических инструментах
используются системные жидкости,
следует убедиться, что они не
контаминируют образцы и реагенты.
3
13. Для того, чтобы быть уверенным в
удовлетворительном
качестве
проводимых
анализов,
следует
проводить инкубацию при температуре
37оС ± 1оС.
14. Не храните стоп реагент в мелкой
посуде или переливайте его обратно в
оригинальный
флакон
после
использования.
СБОР ОБРАЗЦОВ, ТРАНСПОРТИРОВКА И
ХРАНЕНИЕ
СБОР ОБРАЗЦОВ
Образцы сыворотки и плазмы, собранные в
ЭДТА или цитрате, могут использоваться в
данном анализе. Образцам крови, полученным
с помощью венопункции, необходимо дать
возможность свернуться естественным путем.
Следует убедиться, что в образцах сыворотки
сгусток образовался полностью. Все видимые
включения в образцах должны удаляться с
помощь центрифугирования.
ТРАНСПОРТИРОВКА
ОБРАЗЦОВ
И
ХРАНЕНИЕ
Образцы следует хранить при 2-8оС. Образцы,
не проанализированные в течение 72 часов,
следует отделить от сгустка или осевших
эритроцитов и хранить в замороженном виде
при –15оС или ниже.
Избегайте
многочисленных
циклов
замораживания-оттаивания.
ПРОЦЕДУРА АНАЛИЗА
ТРЕБУЕМЫЕ, НО НЕ ПРЕДОСТАВЛЯЕМЫЕ
МАТЕРИАЛЫ
1. Murex HBsAg version 3 (GE34/36, 9F80).
2. Стеклянные или пластиковые пробирки
или микропланшеты для разведения
образцов.
3. Многоканальные пипетки подходящего
объема (от 20 до 100 мкл).
4. Микропипетки в диапазоне объемов от
20 до 200 мкл.
5. Физиологический раствор (0.85 г NaCl в
100 мл дистиллированной воды) для
разведения образцов.
6. Другие материалы и оборудование,
требуемое для теста Murex HBsAg
version 3 (GE34/36, 9F80).
Внимательно ознакомьтесь с разделом Меры
предосторожности при анализе.
Примечания:
1. Ставьте
минимум
по
одному
положительному и отрицательному
контролю при постановке каждого
анализа.
2. Хорошо размешайте контрольный и
специфический
реагенты
путем
переворачивания
флаконов
перед
анализом.
3. Добавление образцов или контролей
может
подтверждаться
визуально
путем наблюдения следующей смены
цвета:
Контрольный реагент меняет
желтый
цвет
на
зеленый
при
добавлении образца или контролей.
Положительный контроль и некоторые
образцы плазмы могут давать не очень
сильные изменения в цвете, но
различимые визуально.
Специфический
реагент
меняет красный цвет на пурпурный при
добавлении контролей или образцов.
Образцы, разбавленные в физ.
растворе, не будут давать изменения в
цвете, или оно будет слабым.
4. Образцы,
дающие
максимальное
поглощение в тесте Murex HВsAg,
следует разбавить 1:100 в физ.
растворе
перед
анализом
в
подтверждающем тесте Все остальные
образцы
могут
тестироваться
неразбавленными.
5. Для каждого образца и контроля
используются по две лунки (см. рис.1).
ПРОЦЕДУРА АНАЛИЗА
Внимательно
ознакомьтесь
с
разделом
Процедура тестирования, содержащимся во
вкладыше к тесту Murex HBsAg version 3
(GE34/36, 9F80) перед проведением анализа.
4
Рисунок 1
Конфигурация теста
Добавить 25 мкл
Контрольного
реагента в
подготовленные
лунки
Столбец
Добавить 25 мкл
Специфического
реагента в
подготовленные
лунки
Добавить 75 мкл
полож. контроля
Добавить 75 мкл
отриц. контроля
Добавить 75 мкл
образца №1
Добавить 75 мкл
остальных
образцов в
требуемое число
лунок
Не используемые
лунки
Этап
1
Приготовить раствор
субстрата и промывающую
жидкость. См. вкладыш к
тесту Murex HBsAg version 3
(GE34/36, 9F80).
Этап Использовать только
2
необходимое для анализа
число лунок. Не прикасаться
ко дну лунок.
25 мкл
Этап Добавить 25 мкл
3
специфического и
контрольного реагентов в
соответствующие лунки (см.
рис.1)
75 мкл
Этап Добавить 75 мкл Murex
4
HBsAg контролей и
образцов в лунки (см. рис.1)
10 сек
Этап Встряхнуть планшет с
5
помощью встряхивателя
планшет в течение 10 сек.
Альтернативно планшет
можно встряхивать вручную
путем легкого постукивания по
краю планшета в течение 10
сек.
Этап Далее следуйте процедуре
6
тестирования, описанной во
вкладыше к тесту Murex
HBsAg version 3 (GE34/36,
9F80).
Относительно деталей процедуры промывки и
использования автоматического процессора
Murex HВsAg Подтверждающий анализ, версия 3
см. вкладыш к тесту к тесту Murex HBsAg
version 3 (GE34/36, 9F80).
РЕЗУЛЬТАТЫ
РАСЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ.
Расчет и интерпретацию результатов следует
проводить
для
каждого
планшета
по
отдельности
независимо
от
количества
планшет, анализируемых в одно и то же время.
Для расчетов и интерпретации результатов
можно использовать одобренное программное
обеспечение.
1. Отрицательный контроль
Рассчитать среднее значение поглощения
отрицательного контроля, инкубированного со
специфическим и контрольным реагентами.
Пример:
А450/690 отриц. контроля со спец. реагентом (NS)
= 0.080
А450/690 отриц. контроля с контр. реагентом (NС)
= 0.086
Всего = 0.166
Среднее отриц. контроля = 0.166/2 = 0.083
2. Значение cut-off
Рассчитывается
как
среднее
значение
поглощения отрицательного контроля + 0.05
3. Положительный контроль
Рассчитать
процент
ингибирования
положительного контроля со специфическим
реагентом
Пример:
А450/690 полож. контроля с контр. реагентом (РС)
= 1.061
А450/690 полож. контроля со спец. реагентом
(РS) = 0.121
Ингибирование спец. реагентом = [(PC-NC) –
(PS-NS)x100/(PC-NC)] = [(1.061-0.086) – (0.1210.080)] x 100/(1.061-0.086) = 95.8%
4. Реактивные образцы
Рассчитать
ингибирование
образцов
реактивных
Пример
А450/690 образца с контр. реагентом (SС) = 0.648
А450/690 образца со спец. реагентом (SS) = 0.099
[(SC-NC) – (SS-NS)] x 100/(SC-NC) = [(0.6480.086) – (0.099-0.080) x 100/(0.648-0.086) =
96.6%
5
Для
образцов,
дающих
максимальное
поглощение
с
контрольным
реагентом,
значение поглощения от 2.0 до 3.0 может
использоваться для расчетов в зависимости от
типа
использующегося
ридера
для
микропланшет.
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Результаты
проведенного
анализа
действительны, если выполняются следующие
критерии для контролей:
Отрицательный контроль
Среднее значение А450/690 меньше 0.15 или
среднее А450 меньше 0.2.
HBsAg положительный контроль
Значения А450/690 или А450 положительного
контроля, инкубированного с контрольным
реагентом, выше на 0.8 по сравнению со
средним
значением
поглощения
отрицательного контроля.
Значение
поглощения
положительного
контроля, инкубированного со специфическим
реагентом, снижается минимум на 80% по
сравнению со значением положительного
контроля, инкубированного с контрольным
реагентом.
В случае если результаты неоднократно не
соответствуют критериям контроля качества
или ожидаемым характеристикам теста,
необходимо связаться с представителем
компании.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Подтвержденный реактивный результат
Для образца, считающегося подтвержденно
реактивным в тесте Murex HBsAg version 3
(GE34/36,
9F80),
должны
выполнять
следующие критерии:
1) Значение поглощения образца с
контрольным реагентом должно быть
равным или выше значения уровня cutoff. Если
образец тестировался
неразбавленным
и
оказался
не
отвечающим данному критерию, он
считается
неопределенным.
Если
образец был разведен и оказался не
соответствующим данному критерию,
его следует протестировать повторно
неразбавленным.
2) Ингибирование
в
реакции
со
специфическим реагентом должно быть
равно или выше 50%. Если в случае
сильно
реактивных
образцов
ингибирование составляет менее 50%,
а значение поглощения с контрольным
реагентом выше 2.0, следует повторить
тестирование образца в разведении
1:100 или 1:10000. Значение иногда
может превышать 100%.
Отрицательный результат
При значении поглощения в контрольных
лунках менее 2.0, образцы, дающие менее 50%
ингибирования со специфическим реагентом,
считаются отрицательными и, следовательно,
ложно реактивными в тесте Murex HBsAg
version
3
(GE34/36,
9F80).
Случаи
отрицательного ингибирования также могут
встречаться, и такие образцы должны
считаться отрицательными.
СПЕЦИФИЧЕСКИЕ
ХАРАКТЕРИСТИКИ
АНАЛИЗА
Всего 49 образцов, оказавшихся реактивными
в по крайней мере двух иммуноаналитических
тестах,
предназначенных
для
детекции
поверхностного антигена вируса гепатита В,
тестировали
в
тесте
Murex
HBsAg
подтверждающий, версия 3 (GE37/2G27).
Образцы были от пациентов с разной стадией
заболевания гепатитом В.
Все образцы были подтверждены без
предварительного разведения в тесте Murex
HBsAg
подтверждающий,
версия
3
(GE37/2G27).
Кроме того, с помощью теста Murex HBsAg
подтверждающий, версия 3 (GE37/2G27)
исследовали 169 образцов, оказавшихся
реактивными в тесте Murex HBsAg version 3
(GE34/36,
9F80)
и
еще
в
одном
иммуноаналитическом тесте для детекции
поверхностного антигена вируса гепатита В. В
данной выборке содержались образцы от
пациентов,
инфицированных
известными
подтипами или мутантными формами гепатита
В.
Все 44 образца, которые в тесте Murex HBsAg
version 3 (GE34/36, 9F80) имели значения ниже
максимального, были подтверждены в тесте
Murex HBsAg подтверждающий, версия 3
(GE37/2G27)
без
их
предварительного
разведения.
Из оставшихся 125 образцов, дававших
максимальные значения поглощения в тесте
Murex HBsAg version 3 (GE34/36, 9F80), 111
образцов
были
подтверждены
после
разведения 1:100 и 14 образцов – после
разведения 1:10000 в тесте Murex HBsAg
подтверждающий, версия 3 (GE37/2G27).
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ АНАЛИЗА
См. также вкладыш с тесту Murex HBsAg
version 3 (GE34/36, 9F80).
1. Подтверждающий
тест
позволяет
отличить
образцы,
являющиеся
6
истинно
реактивными
от
ложно
реактивных в тесте Murex HBsAg
version 3 (GE34/36, 9F80). Было
показано, что данный тест эффективно
выявляет мутантные формы HBsAg,
хотя возможно (как и с любым
нейтрализующим
тестом),
что
некоторые формы HBsAg могут не
ингибироваться. Для
установления
статуса
пациента
в
отношении
инфицирования вирусом гепатита В
данный тест необходимо использовать
в сочетании с другими тестами на
HBsAg и тестами на маркеры вируса
гепатита В, например, анти-НВс IgM,
анти-НВс, НВе, анти-НВе, HBV ДНК.
2. Данный тест должен использоваться
для анализа только индивидуальных
(непулированных) образцов сыворотки
и плазмы, собранной в ЭДТА или
цитрате. Данный тест не исследовался
на предмет использования в других
целях.
3. Некоторые
ложно
положительные
результаты возникают в результате
реактивности на белки животных.
Величина поглощения в этих образцах
снизится
при
реакции
как
с
контрольным, так и специфическим
реагентами.
В
редких
случаях
специфический реагент может давать
более сильный эффект по сравнению с
контрольным реагентом, что после
проведения расчетов может привести к
подтверждающему
результату.
В
данной ситуации, если величина
поглощения
также
существенно
снижается при реакции с контрольным
реагентом, маловероятно, что образец
окажется
положительным,
и
необходимо проводить тестирование
другим методом.
4. Отрицательный результат, полученный
при определении антигена или в
подтверждающем тесте, не исключает
возможности инфицирования вирусом
гепатита В.
Murex HВsAg Подтверждающий анализ, версия 3
Central Road, Temple Hill,
Dartford DA1 SLR
UK
Дистрибьютор в Европе:
ABBOTT
Max-Plank-Ring 2
65202 Wiesbaden
Germany
C04GE37/GB
Март 2002
Производитель:
Murex Biotech Limited
7