Учебное пособие по цитогистохимии
реклама
ГОУ ВПО «Кемеровский государственный университет» Биологический факультет Кафедра генетики ЦИТОГИСТОХИМИЯ Учебно-методическое пособие Кемерово 2010 2 Составитель: Злобина Н. А., канд. биол. наук, доцент Цитогистохимия: учебно-методическое пособие / сост. Н. А. Злобина; ГОУ ВПО «Кемеровский государственный университет».Кемерово, 2010.- 76 с. Учебно- методическое пособие «Цитогистохимия» разработано по курсу «Цитогистохимия» для специальности 020201.65 – Биология, по направлению 020200 – Биология. В учебно-методическом пособии отражены принципы и основные этапы современных методов исследования клеток и тканей: аналитической микроскопии, биохимического анализа, радиоавтографии, иммуноцитохимии, спектрофотометрии. Особое внимание уделено достоинствам и недостаткам того или иного метода исследования. Предназначено для студентов биологического факультета. Утверждено на заседании кафедры генетики « 27 » августа 2009 г. _____________ В.Г.Дружинин Утверждено методической комиссией биологического факультета « 4 » сентября 2009 г. ____________ С.В. Блинова 3 ВВЕДЕНИЕ Учебно-методическое пособие «Цитогистохимия» знакомит студнтов с основными методами исследования клеток и тканей организма. Долгое время цитогистохимия развивалась в основном как аналитическая микроскопия. Только в середине 20 века появились и начали развиваться биохимические методы анализа фракций клеточных органелл, внесшие огромный вклад в изучение клетки. Современные представления о клетках и тканях основываются на достижениях не только аналитической микроскопии, биохимии, но и таких новейших методах исследования как иммуноцитохимический анализ, радиоавтография, проточная цитоспектрофотометрия. Установление химического состава клеточных структур давно уже перестало быть самоцелью в цитогистохимии. Сегодня биолога интересует, прежде всего, функциональная организация клетки, механизмы становления и регуляции жизненно важных процессов. Вмешиваясь в жизнь клетки, исследователь должен хорошо представлять достоинства и недостатки применяемого метода, понимать, что происходит при использовании тех или иных процедур, уметь выбрать адекватный метод для решения поставленной задачи. Настоящее пособие не ставит целью глубоко и полно осветить все существующие цитогистохимические методы. Главная задача пособия – дать краткое систематизированное описание основных подходов к изучению химии клеток и тканей, и показать, какие трудности может встретить биолог-исследователь при анализе как собственных, так и литературных данных. Учебное пособие «Цитогистохимия» может быть использовано студентами для самостоятельного изучения материала. В качестве дополнения для желающих более глубоко вникнуть в методы цитогистохимического анализа дается дополнительная литература. 4 Раздел 1. АНАЛИТИЧЕСКАЯ МИКРОСКОПИЯ Основным объектом исследования в аналитической микроскопии являются гистологические препараты. Главным требованием к препарату, пригодному для микроскопического анализа, является его небольшая толщина: несколько микрометров для световой микроскопии и доли микрометра для электронномикроскопического изучения. В зависимости от метода приготовления цитологического препарата различают: о т п е ч а т к и клеток и тканей (например, селезенки, печени, тимуса), п л е н к и из ткани (например, соединительной или брюшины, мягкой мозговой оболочки или плевры), д а в л е н ы е препараты, м а з к и (например, мазок крови, костного мозга, слюны, спинномозговой жидкости), к л е т о ч н ы е с у с п е н з и и, с р е з ы. Существуют и другие способы приготовления препаратов в цитохимии. Например, при исследовании неорганических веществ в клетке используют метод сподографии (микросжигания). Парафиновые или целлоидиновые срезы тканей сжигают в течение нескольких часов, постепенно повышая температуру до 500-550оС. Осторожное сжигание не вызывает деформации материала. Полученные сподограммы сохраняют морфологические особенности клеток. Их можно оценивать при помощи светового микроскопа, учитывая цвет золы; используя различные индикаторы или проводя дифференциальное растворение минеральных веществ. Сподограммы можно изучать и на электронно-микроскопическом уровне. Для этого золу дополнительно нагревают до 700-1000оС, она плавится. После охлаждения, зола переходит в кристаллическое состояние, и ее можно анализировать методом дифракции электронов. Наибольшее распространение в цитохимии получило изучение с р е з о в клеток и тканей. Их можно получать из свежезамороженного материала в криостате и, в зависимости от задач исследования, фиксировать разными способами или анализировать без фиксации. Можно получать срезы из материала, предварительно фиксированного и помещенного в специальную среду, облегчающую приготовление срезов. 5 Процесс изготовления гистологического препарата для световой и электронной микроскопии включает следующие основные этапы: 1. Взятие материала и его фиксация. 2. Уплотнение материала. Необходимо для приготовления срезов. Производится путем пропитывания предварительно обезвоженного материала парафином, целлоидином, органическими смолами. Более быстрое уплотнение достигается применением метода замораживания кусочков, например, в жидкой углекислоте. 3. Приготовление срезов происходит на специальных приборах – микротомах (для световой микрскопии) и ультрамикртомах (для электронной микроскопии) 4. Окрашивание срезов (в световой микроскопии) или контрастирование срезов (напыление их солями металлов: марганца, кобальта - в электронной микроскопии). Окрашенные препараты обычно обезвоживают в спиртах возрастающей крепости и просветляют в ксилоле, бензоле, толуоле или некоторых маслах. 5. Заключение срезов в канадский бальзам или другие прозрачные среды (этот этап необходим только для световой микроскопии). Прижизненное изучение локализации химических веществ Изучение живых клеток и тканей in vivо или in vitro позволяет получить наиболее полную информацию об их жизнедеятельности. Одним из прижизненных методов исследования является наблюдение структур в живом организме с помощью специальных микроскопов. Другой самый распространенный метод исследования живых структур – изучение клеток и тканей в культуре (in vitro). Выделенные из организма человека и животных клетки, маленькие образцы тканей или органов помещают в стеклянные или пластмассовые сосуды, содержащие специальную питательную среду – плазму крови, эмбриональный экстракт и стимулятры роста клеток. Различают с у с п е н з и о н н ы е культуры (клетки взвешаны в среде) и м о н о с л о й н ы е культуры 6 (эксплантированные клетки образуют на стекле сплошной слой). Обеспечивается стерильность среды и температура, соответствующая температуре тела. В этих условиях клетки в течение длительного времени сохраняют основные показатели жизнедеятельности – способность к росту, размножению, дифференцировке, движению. В настоящее время получены клеточные линии фибробластов, миоцитов, эпителиоцитов, макрофагов, которые существуют многие годы. Необходимо помнить о недостатках метода, которые необходимо учитывать при оценке полученных результатов. Изоляция клеток из целостного организма ведет к ряду изменений условий их существования: утрачиваются взаимосвязи с другими клетками и тканями, действие комплекса нейрогуморальных факторов регуляции. Для устранения этих недостатков применяют культивирование in vivо, когда образцы тканей и органов помещают в камеры из пористого материала, которые подсаживают в участок тела животного (в брюшую полость, под кожу) При в и т а л ь н о м (прижизненном) окрашивании клеток и тканей краситель вводят в организм животного, при этом он избирательно окрашивает определенные клетки, их органеллы или межклеточне вещество. Например, трипановый синий или литиевый кармин выявляет фагоциты, ализарин новообразованный матрикс кости. С у п р а в и т а л ь н ы м окрашиванием называют окрашивание живых клеток, выделенных из организма . Таким способом выявляют молодые формы эритроцитов – ретикулоциты крови, используя краситель бриллиантовый крезиловый голубой, лизосомы при помощи нейтрального красного. Однако возможности прижизненного изучения ограничены несколькими причинами: 1. Извлеченным из организма клеткам трудно создать условия, при которых они были бы доступны для микроскопирования и одновременно сохраняли нативность. По этой причине исключается электронно-микроскопический уровень исследования и, в значительной степени ограничивается круг объектов, изучение которых оказывается информативным (одноклеточные организмы, 7 эпидермальные клетки растений, среди животных клеток - клетки в культуре тканей). Извлечение клеток из организма приводит к нарушению их химизма и, следовательно, к изменению локализации внутриклеточных веществ. 2. Серьезное ограничение связано с токсичностью большинства красителей, применяемых для идентификации клеточных компонентов (десятые, тысячные доли процента). 3. Еще одно ограничение обусловлено малочисленностью красителей, специфично связывающихся с веществами клетки. Один из известных - янус зеленый, окисляющийся в присутствии цитохромоксидазы, используется для идентификации митохондрий. Другой распространенный прижизненный краситель - акридиновый оранжевый, дает спицифическую зеленую флуоресценцию с нативной ДНК (в отличие от красной, возникающей при связывании красителя с РНК или денатурированной ДНК) и применяется для оценки состояния ДНК в клеточном ядре. В последнее время все шире используют иммунофлуоресцентные, иммуноферментные методы, которые позволяют значительно расширить спектор клеточных веществ, доступных для прижизненного изучения. Цитохимический анализ фиксированного материала Главная цель фиксации заключается в том, чтобы убить клетку, сохранив ее в том состоянии, в котором она находилась при жизни. Это значит исключить посмертные изменения (автолиз), закрепить вещества в тех клеточных структурах, в которых они находились в живой клетке. Для этого их нужно перевести в нерастворимое состояние, причем необратимо (так, чтобы они не растворялись и не вымывались при последующих манипуляциях). Фиксация не должна препятствовать идентификации веществ. Для предотвращения посмертных изменений необходимо, чтобы время между взятием материала и его фиксацией было минимальным. Самые ранние посмертные изменения выявляются электронно-микроскопически и касаются изменений структуры различных органелл. Например, в ядре уже через 5 минут 8 наблюдается агрегация хроматина, которая усиливается и через 15 минут приводит к его значительному перераспределению. Особенно важно быстро фиксировать ткани при количественных исследованиях. Наркоз применим не всегда (недопустимо применение эфира или хлороформа при изучении ферментов лизосом). Фиксация должна происходить быстро и по возможности захватывать одновременно все клетки фиксируемой ткани. Для этого фиксируют мелкие кусочки ткани, помещая их не на дно сосуда, а на рыхлые прокладки или используют специальные держатели. Для ускорения химической фиксации пользуются горячими фиксаторами. Однако при высокой температуре ускоряются и посмертные изменения. Гораздо лучшие результаты получаются при температуре фиксатора 0…+4оС, так как при этом процессы автолиза резко замедляются. Химические способы фиксации. Простые фиксаторы – это различные обезвоживающие вещества – этиловый и метиловый спирты; ацетон; соли тяжелых металлов (сулема, хлорид платины); кислоты (уксусная, трихлоруксусная, пикриновая, осмиевая); растворы формальдегида и других альдегидов. Спирт денатурирует белки и осаждает нуклеиновые кислоты. Липиды сохраняют свою растворимость и экстрагируются из клеток в процессе самой фиксации или при последующих процедурах. Гликоген осаждается, но сохраняет свою растворимость в воде. Спирт вызывает сморщивание тканей и их затвердевание. Уксусная кислота быстро проникает в ткани, сохраняет неизменной структуру ядра и хромосом, растворяет липиды, вызывает набухание тканей и их размягчение. Альдегиды реагируют в первую очередь с белками, с группами, содержащими активный атом водорода. Фиксация нуклеиновых кислот достигается взаимодействием с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями и с белковыми компонентами 9 хроматина. Углеводы альдегидами не фиксируются, но они могут удерживаться фиксированными белками. Фиксация липидов возможна при длительном воздействии и осуществляется через этиленовую группу. Альдегидная фиксация уменьшает растворимость липидов в органических растворителях. Чем разветвленнее молекула альдегида, тем выше его фиксирующая способность. При альдегидной фиксации ткани практически не сокращаются. Осьмиевая кислота реагирует в основном с ненасыщенными липидами с образованием моноэфиров. Белки фиксируются непосредственно (за счет взаимодействия осмиевой кислоты с триптофаном, гистидином и цистеином) и, кроме того, в составе мембран удерживаются прочно связанными липидами, что приводит к резкому уменьшению и даже полному исчезновению их ферментативной активности. Осмиевая кислота проникает в ткани медленно и на небольшую глубину, а также препятствует пропитыванию парафином и затрудняет окраску препаратов. Ацетон используется для фиксации при срочных исследованиях, когда не может быть использован замораживающий микротом. Ацетон сильно сморщивает ткани. Хотя у некоторых фиксаторов есть отдельные достоинства, но ни один из них не безупречен. Отсюда естественная тенденция составлять смеси этих химикатов с тем, чтобы получить фиксатор, сочетающий в себе преимущества каждого компонента и свободный от недостатков, присущих каждому из них. Сложные фиксаторы – смеси, состоящие из нескольких фиксирующих веществ. Существует сотни различных рецептов фиксаторов для разных целей, различных тканей, организмов (Пирс, 1962). Один из самых распространенных – смесь формалин уксуная кислота - спирт (ФУС). Логические размышления, лежащие в основе составления смеси ФУС, сводятся к следующему: формалин и спирт фиксируют белки, уксусная кислота нуклеиновые кислоты. Спирт приводит к резкой дегидратации и сморщиванию тканей; уксусная кислота, напротив, вызывает их набухание, препятствует затвердеванию фиксированного материала, которое возникает при действии формалина и спирта. В 10 качестве примера можно привести две прописи смеси ФУС, в которых относительные количества составляющих реактивов резко различаются: Составляющие растворы Смесь 1 Смесь2 40%-й формалин 1 часть 3 части Ледяная уксусная кислота 1 часть 3 части 50%-й этиловый спирт 18 частей 1 часть Соотношения компонентов подбираются эмпирически для тканей разного происхождения так, чтобы недостатки фиксации были минимальными. Если какой-то из недостатков все-таки имеется, например сморщивание ткани, то соотношение компонентов меняется, в данном случае в пользу уксусной кислоты. Выбор фиксатора определяется конкретными задачами каждого исследования. Так, при анализе нуклеиновых кислот используют спирт - уксусные смеси, для белков - преимущественно альдегидные. Жидкость Буэна – фиксатор, который рекомендуется для исследований соединительной и мышечной тканей, для приготовления обзорных препаратов. Смесь состоит из 1 части ледяной уксусной кислоты, 5 частей формалина и 15 частей пикриновой кислоты. Жидкость Карнуа – фиксатор, состоящий из 63 мл абсолютного спирта, 10 мл ледяной уксусной кислоты и 30 мл хлороформа, используется при исследовании ядер, нуклеиновых кислот. Жидкость Шаффера – фиксатор, состоящий из 2 частей абсолютного спирта и 1 части формалина, является универсальным фиксатором, используется для выявления белков. Жидкость Чаччо - составляют смешиванием 80 мл 5% раствора бихромата калия, 20 мл формалина и 5 мл ледяной уксусной кислоты. Применяют для фиксации липидов. Фиксатор Лилли состоит из 8 г нитрата свинца, 10 мл формалина, 10 мл воды и 80 мл этилового спирта. Используют при выявлении мукополисахаридов, мукопротеидов. При выборе фиксатора необходимо учитывать, каким воздействиям в дальнейшем будет подвергаться анализируемый 11 материал. Например, если анализироваться будут срезы, то нужно помнить, что заливка в парафин или целлоидин требует применения большого количества органических растворителей для обезвоживания материала, при этом будет вымываться из клеток все, что было плохо зафиксированно. Следует помнить и о том, что в водных растворах (большинство красителей, инкубационные растворы) также происходят потеря и перераспределение, но уже водорастворимых веществ. Не всегда удается подобрать оптимальный химический фиксатор. Так, химическая фиксация практически неприемлема при изучении активности клеточных ферментов. В этом случае используют физические способы фиксации, основанные на замораживании материала. Затем можно готовить срезы в криостате непосредственно из замороженных кусочков ткани, а можно подвергать их лиофилизации или замещению в замороженном состоянии. Физические способы фиксации Цель замораживания - перевести воду в кристаллическое состояние. Образующиеся кристаллы льда должны быть меньше разрешающей способности микроскопа, для того чтобы не нарушались морфологические структуры клетки. Кристаллы льда тем мельче, чем больше центров кристаллизации. Скорость их возникновения резко увеличивается при низких (ниже –100оС) температурах. Чем быстрее достигается низкая температура, т.е. чем быстрее охлаждается материал, тем больше количество образующихся кристаллов и тем они мельче. Высокая скорость замораживания уменьшает токсическое действие концентрированных солевых клеточных растворов, которые возникают при переходе воды в кристаллическое состояние. Таким образом, главным условием успешного замораживания является быстрота охлаждения ткани (более 1 000оС). Для этого необходимо подвергать замораживанию очень небольшие кусочки ткани (не толще 1-2 мм), однако следует учитывать, что даже при таких размерах замораживание не будет одинаковым по всему объему кусочка. Лучшие результаты будут во внешнем слое. 12 Важен характер охлаждающей жидкости. Обычно используют какое-либо органическое вещество с низкой температурой замерзания и высокой теплоемкостью, которое охлаждают жидким азотом. Это может быть изопентан (температура замерзания 165оС), изопентан-бутан (-190о С), пропан (- 185о С). Замораживание непосредственно в жидком азоте (-195оС) не применяется. Так как при этом вокруг охлаждаемого кусочка ткани возникает оболочка из газообразного азота, обладающего низкой теплопроводностью. Поэтому охлаждение материала идет медленнее (400о/с, по сравнению с 4 000о/с при замораживании, в охлажденном жидким азотом, пропане). Мелкокристаллический лед, возникающий при быстром замораживании, является неустойчивым образованием. При повышении температуры происходит рекристаллизация с образованием более крупных кристаллов, которые могут нарушить целостность внутриклеточных структур. Повышение температуры обязательно происходит при последующих процедурах приготовления препаратов. Выделение тепла наблюдается при ударе микротомного ножа о блок. Монтировка среза и его дальнейшая обработка часто проводятся при температурах около 0о С и выше. Все эти моменты учитывают и подбирают конкретно для каждого образца условия, при которых повреждения клеток минимальны и не выявляются при микроскопии. Оптимальным было бы избежать повреждающего действия рекристаллизации, путем быстрого нагревания образца сравнимого со скоростью замораживания. Однако, на практике это не достижимо. Остается один путь - избавиться от наличия воды в замороженном материале. Для этого существует два способа: лиофилизация и метод замещения в замороженном состоянии. Лиофилизация (лиофильная сушка) достигается возгонкой льда при низких температурах (обычно около –30о ... –40о С) в вакууме. Для того, чтобы сушка проходила с достаточной скоростью, необходима дополнительная энергия, которая поступает к образцу за счет теплопроводности или обеспечивается излучением. Широко 13 применяется высушивание при пониженном давлении в токе сухого газа. Выбор условий лиофилизации зависит от типа ткани и осуществляется эмпирически. Температура, при которой ведется высушивание, определяется температурой замерзания тканевой жидкости и зависит от концентрации солей в данном типе клеток. Богатые неорганическими солями ткани подлежат высушиванию при более низких температурах (-55оС). Время полного высушивания образца зависит от его размера и тканевой принадлежности. В среднем оно составляет около суток, но может быть и значительно больше. Для последующего приготовления препаратов, высушенную ткань обычно заливают в парафин. Во время пропитывания парафином возможна диффузия липидов и других неполярных соединений. При контакте с воздушной средой происходит увлажнение материала, которое влечет за собой диффузию водорастворимых веществ. Поэтому блоки и срезы стараются хранить при пониженной температуре в эксикаторах с поглотителями влаги. Недопустимо расправлять срезы в воде. Их либо монтируют на сухом подогретом стекле и затем фиксируют, либо расправляют срезы непосредственно в фиксаторе. Метод лиофилизации состоит из многих этапов, каждый из которых требует специального контроля и может вносить свои артефакты: высушивание проводится при температурах, при которых нельзя исключить процессы рекристаллизации; сложно контролировать подогрев высушенного материала, так как термический градиент зависит от свойств и толщины образца. Недостаточное высушивание само по себе может приводить к неконтролируемым изменениям ткани. Совершенствование метода лиофилизации привело к возникновению метода замещения в замороженном состоянии. После замораживания образца проводят удаление воды из материала, замещая ее жидкостями, замерзающими при низких температурах. Сначала материал пропитывают жидкостью, которая растворяет кристаллы льда (обычно используют этиловый спирт). Замещение проводят при температурах около –30о...-40о С. Затем спирт замещают органическими растворителями типа толуола. 14 После этого материал переносят в термостат, где происходит пропитка парафином. Такая последовательность процедур, позволяет избежать недостатков метода лиофилизации, связанных с трудностью контроля за температурой высушивания и определения времени окончательного обезвоживания. Однако, при этом фиксации материала также не происходит. Специально проведенные исследования показали, что картина фиксации определяется тем веществом, в соприкосновение с которым материал вступает первым при комнатной температуре. Например, если расправлять срезы в формалине, то картина фиксации больше будет напоминать формалиновую. Это послужило толчком для дальнейшей модификации метода замещения: после растворения кристаллов льда в спирте, спирт замещают фиксатором и затем повышают температуру до комнатной. Оказалось, что при фиксации обезвоженных тканей фиксаторы ведут себя немного не так, как при фиксации свежего материала. Спирт, например, не вызывает грубой грануляции содержимого клеток, а сохраняет их тонкую структуру. Осмиевая кислота в обезвоженную ткань проникает гораздо быстрее и на большую глубину, при этом сохраняется активность некоторых ферментов. Уплотнение материала и приготовление срезов Для изучения с помощью микроскопа толстые кусочки органов непригодны, т.к. они непрозрачны. Чтобы кусочек органа можно было микроскопировать, его следует резать на пластинки – срезы, толщина которых составляет сотые или даже тысячные доли миллиметра. Сделать такие срезы от руки невозможно. Существуют специальные приборы – микротомы, которые позволяют разрезать кусочек органа на тончайшие пластинки; толщину пластинок можно регулировать с помощью особых приспособлений. Но для того чтобы резать на микротоме кусочек ткани, его надо предварительно уплотнить. Это достигается путем замораживания кусочка (его режут тогда на особом замораживающем микротоме) 15 или путем пропитывания его застывающими жидкостями – жидким парафином, который застывает при определенной температуре, раствором целлоидина в смеси равных частей абсолютного спирта и эфира или глицерин-желатиной. Ни целлоидин, ни парафин в воде не растворяются, и поэтому промытый после фиксации кусочек органа необходимо предварительно обезводить и лишь после этого пропитывать целлоидином или парафином. Таким образом, приготовление микротомных срезов включает следующие манипуляции: промывку и обезвоживание кусочка ткани; заливку в парафин или целлоидин; резание кусочка ткани на микротоме П р о м ы в к о й обеспечивается первоначальное очищение материала от самого фиксатора и различных осадков фиксирующих жидкостей. Обычно промывают фиксированный материал в проточной воде в течение 24-48 часов или в спиртах различной концентрации. Промывку проводят в большой емкости (стеклянный сосуд), который необходимо обвязать марлей. Через отверстие в марле на дно сосуда необходимо пропустить резиновый шланг и присоединить его к водопроводному крану. Материал помещают в сосуд в марлевых мешочках. Обезвоживание После промывки фиксированный материал нужно тщательно обезводить. Для обезвоживания служит набор (или батарея) спиртов (этиловый, реже другие спирты) повышающейся концентрации. Большое значение для получения хороших микроскопических препаратов имеет постепенность обезвоживания. Чем нежнее препарат и чем больше опасность его сжатия или сморщивания, тем последовательнее надо повышать крепость спирта. Лучше всего приготовить ряд спиртов повышающейся концентрации (Табл.1). Время пребывания материала в спиртах различно для разных тканей, как правило, выдерживают в каждом спирте не менее 24 часов. Чтобы получить абсолютный спирт, можно к 96º спирту добавить обезвоживающие агенты, например окись кальция (известь) или обезвоженный медный купорос. 16 Таблица 1 Приготовление спиртов различной концентрации Для получения 100мл спирта 40º 45º 50º 60º 70º 80º 90º Нужно взять миллилитров 96º Дист. 90º Дист. спирт вода спирт вода 42 47 52 63 73 83 94 58 53 48 37 27 17 6 44 50 56 67 78 89 - 56 50 44 33 22 11 - Заливка материала в парафин Для того чтобы приготовить срезы, необходимо обезвоженные кусочки материала залить в застывающую среду для уплотнения и затем резать их на микротоме. При заливке в парафин в качестве промежуточных сред между спиртом и парафином, кроме ксилола, могут быть использованы хлороформ и бензол. Преимущество заливки в парафин заключается в относительной быстроте, возможности получения весьма тонких срезов (до 3 и 5 мкм) в виде серий, что особенно важно для гистологических работ. Из недостатков парафиновой заливки нужно отметить действие высокой температуры (56-58ºС), что небезразлично для строения ткани (сжатие материала на 8-20%), и необходимость в дополнительной процедуре удаления парафина перед окраской. Для заливки кусочков ткани употребляют белый или перегретый продолжительным кипячением желтый парафин, имеющий точку плавления не выше 52-54ºС. Для большей пластичности парафина хорошо прибавить к нему до 5% пчелиного воска. Приготовление парафина. В большую емкость наливают более 2/3 воды, помещают парафин (на один палец) и кипятят неделю, выключая на ночь. Ежедневно утром достают охлажденный 17 парафин и соскабливают нижний слой на 2 мм до появления блеска. На 5 день к парафину добавляют пчелиный воск (1-2% на весь парафин) и кипятят еще 2 дня, соскабливая нижний слой. Затем помещают парафин в фарфоровом стакане в термостат при 56-58ºС, и расплавленный парафин фильтруют через фильтровальную бумагу в термостате. Для окончательной заливки необходимо иметь в термостате расплавленный в колбе парафин. Заливку материала производят либо в специальных металлических формочках, либо в формочки, изготовленные из бумаги. Материал располагают на дне формочки и осторожно заливают жидким парафином, а затем формочку переносят в холодную воду, пока не застынет парафин. Чем быстрее наступило охлаждение и затвердение парафина, тем лучше происходит резание парафиновых блоков. Из затвердевшего парафина вырезают прямоугольные блоки с залитыми кусочками, вокруг которых остается слой парафина шириной 1-2 мм. Такой блок прикрепляют к деревянному кубику, предварительно налив на последний немного расплавленного на шпателе парафина и проводя горячим шпателем по нижней поверхности блока, чтобы блок прочно прикрепился к кубику. Микротомы – приборы для приготовления срезов тканей нужной толщины. Они бывают разной конструкции и назначения: ротационные, санные, замораживающие. Наиболее распространенные - санные микротомы устроены таким образом, что столик с объектом поднимается на определенную высоту (соответствующую толщине среза), а движущийся в горизонтальной плоскости нож режет блок. Таким образом, в санных микротомах нож и объект подвижны. Микротом санный с автоматической подачей (Рис.1) состоит из следующих частей: станины (1), суппорта с ножедержателем (ножевые салазки с ножом) (2), механизма микроподачи (3) [механизм микроподачи имеет микровинт (4), который связан с механизмом подъема столика разъемочной гайкой], механизма подъема столика (объектные салазки с объктодержателем) (5). 18 2 6 1 5 3 4 7 8 Рис. 1. Санный микротом с автоматичской подачей На лицевой стороне станины имеются 2 наклонные направляющие (6) для перемещения подъемника столика, а в правой части этих направляющих закреплен кронштейн автоматической микроподачи, который смонтирован под станиной. На кронштейне установлен лимб (7) с делением для контроля микроподачи и с рукояткой для подачи объекта вручную. Установленную величину микроподачи можно определить по шкале (8), каждое деление которой равно 1 мкм (Рис.1). Для приготовления парафиновых срезов из затвердевшего парафина вырезают блок, который должен иметь широкое основание. Тщательно обрезанный блок наклеивают расплавленным парафином на деревянный кубик, который укрепляют в блокодержателе микротома и фиксируют непосредственно к столику микротома. Угол наклона ножа к поверхности объекта устанавливается в каждом случае опытным путем. При изготовлении парафиновых срезов могут быть неудачи. Если парафин слишком мягкий, срезы будут сморщиваться; в этом случае парафиновый блок при резании надо охлаждать. При 19 слишком твердом парафине срезы будут крошиться и скручиваться; чтобы избежать этого, нужно делать более тонкие срезы и подогревать блок, поместив около него электрическую лампочку. Если блок правильно обрезан, то срезы ложатся на нож в виде ленты или серии. В тех случаях, когда на ленте образуется заметная продольная полоса или серия расщепляется, необходимо проверить лезвие ножа; обычно это явление связано с имеющимися на ноже зазубринами. Получаемые срезы снимают с лезвия ножа мягкой кисточкой, смоченной в воде, или препаровальной иглой и переносят на предметное стекло в каплю теплой дистиллированной воды (предметные стекла располагаются на столике для расправления срезов с нагретой до 40º поверхностью). Срезы тотчас расправляются. Срезы кладут на воду той стороной, которая была обращена к ножу. Предметные стекла с парафиновыми срезами высушивают в течение 24 часов в термостате при 37ºС. Для более прочного приклеивания парафиновых срезов предметные стекла предварительно необходимо смазать смесью белка с глицерином. Для этого на обезжиренное предметное стекло наносят маленькую капельку смеси белка с глицерином и тщательно размазывают на стекле тонким слоем. Руки должны быть предварительно вымыты и обработаны спиртом. Нанесенный на предметное стекло тонкий слой смеси нагревают, для чего стекло проводят 2-3 раза над пламенем спиртовки. После такой обработки предметное стекло считается готовым и на него можно выкладывать парафиновые срезы. Общие принципы идентификации веществ в клетке Микроскопическую идентификацию клеточных веществ можно проводить, основываясь на их физико-химических свойствах и регистрируя результаты их биологической активности in vivo, in vitro или in situ. На светомикроскопическом уровне обычно анализируют спектры поглощения или излученя красителей, специфически связавшихся с клеточными компонентами, либо их собственные спектры поглощения или излучения. Примером 20 другого подхода является выявление активности клеточных ферментов по регистрируемым продуктам реакции. Светомикроскопический цитохимический анализ разработан для веществ, поглощающих свет в видимой части спектра и в ближней ультрафиолетовой области с длинами волн соответственно 400-750 нм и 240-400 нм. Поглощение определяется веществами, содержащими углеродные цепочки, в которых чередуются двойные и одиночные связи. В таких цепочках возникает эффект сопряжения связей, конечным проявлением которого является оптическое поглощение. Эту систему, определяющую цвет вещества, называют хромофором молекулы. Чем более протяженна система сопряжения, тем в более длинноволновую область смещается оптическое поглощение и тем глубже цвет вещества. В основе наиболее распространенных хромофоров лежат хиноидные кольца и азогруппы (-N=N-). Хромофорная группа может содержать атомы тяжелых металлов (такие красители могут быть использованы в световой и в электронной микроскопии). Разрыв цепи сопряжения за счет восстановления двойной связи приводит к повыщению цвета или даже его исчезновению. На этом свойстве основано действие индикаторов, у которых длина цепи сопряжения меняется в зависимости от рН среды. Цвет вещества зависит не только от хромофора, но и от того, с какой электронодонорной или электроноакцепторной группой он связан. Введение электронодонорных (-ОН, -NН2) или электроноакцепторных (-NO2 , >C = NH, >C = O) групп в молекулу, содержащую хромофор, приводит к некоторому смещению заряда в цепи сопряжения и к изменению окраски. Электронодонорные и электроноакцепторные группы, способствующие углублению и усилению окраски, называются ауксохромами. Цвет вещества зависит такж от степени ионизации молекулы: одно и то же вещество будет окрашено по разному в полярных и неполярных растворителях. Из внутриклеточных компонентов в видимой области спектра свет поглощают некоторые пигменты. Наиболее важные 21 компоненты клеток, такие как белки и нуклеиновые кислоты, поглощают свет в ультрафиолетовой (УФ) области спектра. Возможности изучения собственного излучения (первичная флуоресценция) клеточных компонентов также ограничены. Собственной видимой флуоресценцией обладают пигменты, в частности хлорофилл, катехоламины, некоторые витамины. Нуклеиновые кислоты, белки, полисахариды дают УФфлюоресценцию. Подавляющее большинство методов цитохимического анализа основано на использовании красителей. Вещества, поглощающие свет в видимой области спектра, воспринимаются нами как окрашенные. Их цвет определяется длиной волны пропускаемого света и является дополнительным к цвету поглощаемых лучей, т. е. вместе они составляют ощущение белого цвета. Кроме того, цвет вещества зависит от интенсивности поглощения, которая определяет насыщенность окраски. Существует несколько классификаций красителей построенных на разных принципах. Одна из них основана на принадлежности хромофора к тому или иному классу органических соединений, например: дифенил- и трифенилметановые красители, тиазиновые красители, ксантеновые и акридиновые красители, азокрасители и т. д. : Аурамин- дифенилметановый краситель Метиленовый синий – тиазиновый краситель Родамин В – ксантеновый краситель Акридиновый желтый – акридиновый краситель Бисмарк коричневый - азокраситель Основанием для другой классификации служит тип связи, возникающий при взаимодействии красителя с веществом, прежде всего ковалентной или ионной. Красители, образующие прочные к о в а л е н т н ы е связи с окрашиваемым веществом, называют активными красителями. Молекула такого красителя, кроме хромофора, содержит активную (реакционную) группу, определяющую возможность образования ковалентной связи с функциональными группами вещества. Активная группа соединена с хромофором через мостиковую 22 группу. Примером активного красителя может служить проционовый ярко-голубой R. В качестве мостиковых групп часто выступают NH -, SO2 -, NH-SO2 и NHSO-. Активная группа определяет условия, при которых краситель взаимодействует с веществом. Активными группами наиболее распространенных в биологии красителей, так называемых проционов, служат производные триазина. Красители могут содержать несколько активных групп (одинаковых или разных), что увеличивает прочность связи красителя с веществом. Активные красители можно использовать как витальные, а затем ткань фиксировать и готовить препарат для микроскопирования. Прочность связи красителя с веществом такова, что она не разрушается при этих процедурах. Это дает возможность пометить конкретную клетку, характеристики которой изучались при жизни (допустим, измерялся потенциал), а затем исследовать ее цитохимически. Введение метки в виде активного красителя, связавшегося с определенными белками и углеводами, позволяет проследить динамику их перемещения в клетках и тканях и, таким образом, заменить радиоавтографическое мечение. Красители, образующие и о н н ы е связи с веществом, обязаны способностью к диссоциации ауксохромной группе. В зависимости от того, является окрашенным катион или анион, выделяют основные или кислотные красители: Эозин К - кислотный краситель Пиронин Ж - основной краситель Краситель может содержать одновременно электронодонорную и электроноакцепторную ауксохромные группы и, следовательно, являться амфотерным - фуксин кислый (рубин С). В смеси кислотные и основные красители могут образовывать солеобразные соединения, и тогда говорят о нейтральных красителях. Примером может являться азур II-эозин – распространенный краситель для дифференциального окрашивания хромосом (краситель Гимза или Романовского): эозин, азур II – смесь азура I с метиленовой синью в соотношении 1:2. В свою 23 очередь, азур I – это хлорид диметилтионина с примесью хлорида триметилтионина: Если характеризовать красители с точки зрения ауксохромных групп, то можно выделить индифферентные красители – вообще не содержащие способной к диссоциации группы. Это жирорастворимые красители типа суданов. Они используются для выявления липидов. В последние десятилетия в цитохимии нуклеиновых кислот широко применяют новый тип красителей – интеркалирующие красители. К ним относятся в первую очередь акридиновые красители: профлавин, акридиновый оранжевый, акрифлавин, акридиновый желтый. Взаимодействие этих красителей с нуклеиновыми кислотами, происходит в две стадии. Вначале имеет место электростатическое связывание красителя с внешней стороной полимера за счет притяжения катионов азотосодержащего кольца к отрицательно заряженным фосфатным группам цепи нуклеиновых кислот. Затем внешняя связь диссоциирует, происходит внедрение молекулы красителя в спираль со стороны малой бороздки между соседними парами оснований (плоскость молекулы интеркалированного красителя почти перпендикулярна оси спирали и параллельна плоскостям оснований). Для молекулы акридина показано, что его N-кольцо располагается относительно водородных связей соседних пар оснований так, что возможно максимальное взаимодействие электронов. Дополнительная стабилизация комплекса достигается гидрофобными взаимодействиями между парами оснований и кольцами красителя. Если поглощение света (видимого или УФ) сопровождается его излучением, то мы имеем дело с люминесценцией и соответственно с люминесцирующими, а точнее с флуоресцентными красителями. С точки зрения других классификаций флуоресцентные красители могут быть самыми различными: содержать хромофоры разной химической природы, относиться к классу активных красителей, быть кислотными или интеркалирующими и т. д. 24 Главным достоинством методов, основанных на применении флуорохромов, является их высокая чувствительность, превышающая на порядок методы, использующие нефлуоресцентные красители. Использование флуорохромов позволяет выявлять вещества, находящиеся в клетке в очень низких концентрациях. Флуорохромы незаменимы при прижизненном изучении клеток, так как их можно вводить в клетку в очень небольших количествах. Флуоресцентные красители в некоторых случаях оказываются более предпочтительными в количественных фотометрических исследованиях, поскольку позволяют избежать ошибки распределения . В соответствующих условиях свет флуоресценции пропорционален только количеству вещества и не зависит от его распределения. Метах ромазия При окрашивании некоторых клеточных компонентов спектр поглощения комплекса краситель – вещество может отличаться как от спектра поглощения самого красителя, так и от спектра поглощения других окрашенных веществ клетки. Это явление получило название метахроматическое окрашивание (метахромазия). В отличие от отортохроматичского окрашивания, когда спектр поглощения комплкса краситель-вещество совпадает со спектром поглощения самого красителя. В результате появляются отчетливо выраженные цветовые контрасты. Метахромазию можно получить при использовании многих красителей, в том числе и флуоресцирующих (толуидиновый синий, метиленовый синий, азур II, основной фуксин, судан черный, акридиновый оранжевый). Механизм возникновения метахромазии становится понятным при изучении поглощения растворов красителя разной концентрации. Так, растворы акридинового оранжевого низкой концентрации дают зеленую флуоресценцию. При повышении концентрации красителя в растворе возникают димерные ассоциаты, для которых характерно красное свечение. Это свойство акридинового оранжевого нашло применение при установлении 25 степени нативности ДНК (зеленая флуоресценция в отличие от красной флуоресценции РНК и денатурированной ДНК). Детальный анализ эффекта возникновения метахромазии был проведен для толуидинового синего. Показано, что в растворах разной концентрации он может существовать в мономерной (-), димерной (-) и полимерной (-) формах. -форма дает синюю окраску, -форма – фиолетовую и -форма – красную. Фиолетовое окрашивание может появляться как в результате преобладания формы, так и при одновременном присутствии красителя в - и формах. Метахроматическое окрашивание может достигаться взаимодействием молекул разных красителей. Например, дифференциальность окрашивания хромосом красителями Гимза или Романовского определяется именно тем, что в разных участках хромосом формирование красящего комплекса происходит поразному. Метиленовый синий (или азур) взаимодействует с ДНК за счет ионных связей с частичным интркалированием. В тех местах хромосом, где ДНК наиболее доступна для тиазиновых красителей, возникает их высокая концентрация, и они начинают взаимодействовать между собой через молекулы эозина, что приводит к возникновению дифференциального окрашивания. Специфичность выявления внутриклеточных веществ Специфичность взаимодействия красителя с веществом – необходимое условие проведения цитохимической реакции. Методов, в которых специфичность определяется непосредственным специфичным взаимодействием красителя с веществом, не очень много. Среди них можно назвать метод Браше, основанный на применении метилового зеленого с пиронином – смеси двух основных красителей, взаимодействующих с остатками фосфорной кислоты и используемых для дифференциального выявления ДНК и РНК. ДНК окрашивается метиловым зеленым в сине-зеленый цвет, РНК – пиронином в розовый цвет. Причем настоящей специфичностью обладает лишь метиловый зеленый, а пиронин окрашивает как РНК, 26 так и ДНК. Однако интенсивность его взаимодействия с ДНК много ниже, чем с РНК. При одновременном использовании двух красителей слабо-розовый цвет комплекса ДНК-пиронин полностью маскируется интенсивным сине-зеленым цветом связанного с ДНК метилового зеленого. Другими словами, это тот случай, когда краситель хотя и не обладает абсолютной специфичностью, тем не менее успешно используется для цитохимической идентификации вещества. Очень часто специфичность окрашивания обуславливается не самим красителем, а зависит от способа предварительной обработки материала. Примером такого красителя может служить реактив Шиффа, используемый для выявления самых разных веществ. Наиболее известны реакция Фельгена для обнаружения ДНК и ШИК-реакция на полисахариды. Основой реактива Шиффа является парарозанилин (основной фуксин) – представитель трифенилметановых красителей. В ходе приготовления реактива Шиффа к водному раствору парарозанилина красного цвета добавляется сернистая кислота и раствор становится бесцветным (парарозанилин превращается в лейкофуксин). В такой форме краситель очень легко вступает в реакцию с двумя альдгидными группами с образованием соединения пурпурного цвета. В зависимости от условий предварительной обработки клеток альдегидные группы будут выявляться в разных классах веществ. 1. Реакция Фельгена - для обнаружения ДНК используют мягкий кислотный гидролиз в соляной кислоте, который приводит к возникновению альдегидных групп на месте отщепившихся пуриновых оснований. 2. ШИК-реакция - для выявления полисахаридов используют специфичное взаимодействие йодной кислоты или ее солей с 1,2- гликолевыми группами в остатках глюкозы. 3. Реакция с белками происходит после обработки их нингидрином или аллоксаном, которые реагируют со свободными NH2 –группами аминокилот с образованием альдегидных групп. 4. Ненасыщенные липиды вступают в реакцию с лейкофуксином после обработки надмуравьиной кислотой. 27 По аналогии с фуксинсернистой кислотой можно привести множество других примеров. Так, одни и те же соли тетразолия применяются для выявления активности самых разных НАД - или НАДФ - зависимых дегидрогеназ, при этом специфичность реакции зависит от условий ее протекания и используемого субстрата. Бесцветная соль тетразолия при восстановлении превращается в ярко-окрашенный продукт – формазан, который указывает на локализацию и активность фермента. Следует упомянуть большую группу методов, в которых специфичность взаимодействия обусловлена неокрашенными веществами, а уже к ним присоединена окрашенная или окрашивающаяся метка. Это прежде всего иммунофлуоресцентные методы анализа белков и методы гибридизации нуклеиновых кислот in situ с использованием биотина. Специфичность может быть выражена в различной степени. Например, реакция Фельгена является специфичной в целом для ДНК, окраска акрихином позволяет идентифицировать участки, обогащенные АТ-парами, но только гибридизация in situ с мечеными фрагментами ДНК или РНК дает возможность локализовать конкретные нуклеотидные последовательности. Если говорить о белках, то методы их выявления, основанные на реакциях обнаружения определенных аминокислот, оказываются специфичными для всех внутриклеточных белков (хотя реакция на основные аминокислоты, благодаря их высокому содержанию в гистонах, позволяет идентифицировать этот класс белков отдельно). Уникальные белковые молекулы можно обнаружить, лишь применяя иммунологические методы. Контроль специфичности окрашивания является обязательным этапом цитохимического анализа и предворяет проведение опыта или сопровождает его. Выбор контроля зависит от условий конкретной цитохимической реакции. Если специфичность реакции основана на выявлении определенной реакционноспособной группы (например, боковой - СООН-группы в аспарагиновой и глутаминовой кислотах), то контроль будет заключаться в блокировании этой группы (в данном случае с помощью метилирования). 28 При определении локализации и интенсивности ферментативной активности проверкой специфичности будет инкубация анализируемых клеток в среде без специфического для данного фермента субстрата. Для контроля специфичности окрашивания можно применять избирательную экстракцию вещества. Экстракцию можно проводить ферментативную (при хорошей чистоте фермента и его высокой активности метод дает хорошие результаты) или химическую. Метод дифференциальной экстракции используется не только для проведения контроля, но и имеет самостоятельное значение в цитохимии некоторых соединений. Например, метод обнаружения основных белков с помощью прочного зеленого требует предварительного экстрагирования РНК и ДНК трихлоруксусной кислотой, поскольку в условиях проведения реакции краситель взаимодействует не только с основными аминокислотами, но и с нуклеиновыми кислотами. УФ-микроскопия нуклеиновых кислот (и в значительной мере электронная микроскопия) также связана с дифференциальной экстракцией, но на этот раз РНК. Методы избирательной экстракции применяют в цитохимии липидов, возможности которой крайне ограничены из-за отсутствия специфических красителей. Вопросы для самоконтроля 1. Виды препаратов в зависимости от способа их приготовления. 2. Какой из способов приготовления препаратов позволяет определять неорганические вещества в клетке? 3. Ограничения прижизненного изучения клеток. 4. Какой прижизненный краситель используется для выявления митохондрий? 5. Основная цель фиксации. Условия необходимые для успешной фиксации. 6. При какой температуре фиксатора получаются самые хорошие результаты? 29 7. Способы фиксации и их характеристика. 8. Основные фиксирующие жидкости и их характеристика. 9. Какие компоненты клетки фиксирует этиловый спирт? 10. Какой из фиксаторов можно использовать для фиксации липидов в ткани? 11. Сущность метода замещения в замороженом состоянии. 12. Какое вещество используется для растворения кристаллов льда при замещении воды в замороженных тканях? 13. Лиофилизация. Основные условия лиофильной сушки. 14. Основная характеристика физических способов фиксации. 15. Хромофоры и их характеристика. 16. Какие группы в молекуле красителя способствуют углублению и усилению окраски? 17. Принцип поглощения света веществами. 18. Классификации красителей. 19. Активные красители и их преимущества. 20. Основные, кислотные амфотерные красители. 21. Нейтральные, индифирентные красители. 22. Интеркалирующие красители, механизм их действия. 23. К какому типу красителей относится судан черный? 24. Флюоресцентные красители и их преимущества. 25. Какие вещества клетки обладают собственной видимой флюоресценцией? 26. Метахромазия, механизм ее возникновения. 27. В какой форме должен присутствовать в растворе толуидиновый синий, чтобы наблюдалось красное окрашивание? 28. Какие компоненты клетки выявляют с помощью реактива Шиффа? 29. Для чего при окраске по Фельгену или ШИК-реакции после реактива Шиффа препарат промывают в водой, содержащей сернистый газ, а затем проточной водой? Можно ли пренебречь промывкой в сернистой воде? 30. Для определения каких веществ в клетке используется метод Браше? 31. Контроль специфичности окрашивания. 30 Раздел 2. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ При использовании биохимических методов исследования анализируемый материал находится в условиях, при которых сохраняется подвижность и реакционная способность составляющих его молекул в течение всего длительного времени, необходимого для проведения многочисленных процедур. Об этом следует постоянно помнить и проводить все манипуляции как можно быстре и при температуре 0 – 4оС, обеспечивающей отсутствие деятельности ферментов. Предосторожности нужны уже на первом этапе – доставки материала в лабораторию, особенно если речь идет о животных. В этом случае следует максимально сократить время между забоем и исследованием ткани. Извлеченную ткань или орган как можно быстрее охлаждают, помещая в заранее охлажденную среду (например, жидкий азот). Более эффективно охлаждение мелких кусочков ткани. Биохимические методы анализа клеточных структур складываются из трех последовательных этапов: 1. Гомогенизация клеток. 2. Фракционирование. 3. Анализ фракций. Гомогенизация клеток Гомогенат должен удовлетворять следующим требованиям: 1. Должно быть достигнуто разрушение максимального количества клеток. Так как в противном случае неразрушенные клетки будут флотировать при центрифугировании, и их содержимое будет загрязнять фракции на всех этапах очистки, кроме того, уменьшится выход органоидов. 2. Внутриклеточные структуры должны остаться неповрежденными; это даст некоторую гарантию того, что не будет перераспределения веществ между ними. 3. Необходимо создавать условия, предотвращающие агглютинацию частиц, которая способствует потере веществ и загрязннию фракций. 31 Контроль за степенью гомогенизации осуществляется с помощью либо фазово-контрастного, либо темнопольного микроскопов, которые позволяют довольно надежно узнавать только клеточные ядра. Несовершенство такого контроля очевидно. В настоящее время имеется множество способов гомогенизации, основанных на различных принципах: от осмотического шока до применения ультразвука или детергентов. Однако самым распространенным является способ механического разрушения клеток в гомогенизаторах. Существует большое количество гомогенизаторов разной конструкции. Самые простые это обычные стеклянные гомогенизаторы и ступки со стеклянными шариками и песком. Есть и более сложные установки, в которых можно регулировать скорость движения и силу давления. Способ гомогенизации и тип гомогенизатора выбирается в зависимости от целей исследования. Так, при выделении плазматических мембран эритроцитов млекопитающих лучшим способом оказывается осмотический шок. Если предполагается изучение митохондрий из клеток печени, то методы гомогенизации должны быть более жесткие, чем в случае выделения плазматических мембран тех же клеток. Разные ткани также требуют различных условий гомогенизации. Кроме того, условия гомогенизации варьируют при переходе с одного объекта на другой. Следует учитывать даже возраст животного, так как показано, например, что плазматические мембраны клеток животных разных возрастных групп отличаются по хрупкости и склонности к образованию пузырьков. Таким образом, условия гомогенизации подбирается эмпирически для каждого конкретного случая, причем у любого исследователя имеются свои излюбленные приемы. Большую трудность представляет выбор подходящей среды для гомогенизации. Среды можно подразделить на водные и безводные. Основой водной среды традиционно является сахароза. Чаще всего используют 0.25 М раствор сахарозы. Существует бесчисленное множество рецептов, различающихся по концентрации сахарозы, рН, добавлению буфера, ЭДТА, катионов, макромолекулярных веществ. 32 При выборе концентрации тех или иных составляющих среды приходится учитывать самые разные условия. Так, например, установлено, что при выделении мембран ЭПС лучшая морфологическая сохранность мембран достигается применением 1.46 М сахарозы в качестве среды для гомогенизации и центрифугированием в 0.88 М сахарозе. Однако, одновременно показано, что высокие концентрации сахарозы подавляют активность некоторых ферментов при дальнейшем анализе. При концентрации сахарозы 1.2 М активность АТФазы шероховатых микросом снижена на 75% по сравнению с той, которая выявляется при концентрации сахарозы 0.15 М. В то же время низкая концентрация сахарозы может вызывать необратимую агрегацию микросом. Учитывая все сказанное выше, исследователь эмпирически подбирает концентрацию, которая наилучшим образом удовлетворяет целям исследования. Клетки различных тканей одного и того же вида неодинаково реагируют на одни и те же растворы. Например, лизосомы печени агглютинируют в солевых растворах, а лизосомы селезенки сильнее агглютинируют в 0.25 М растворе сахарозы, чем в 0.2 М хлористом калии. Важную роль играют двухвалентные катионы. Высокая концентрация ионов магния и кальция (1 – 3 мМ) необходима для стабилизации хроматина. Концентрация двухвалентных ионов определяет морфологическое состояние мембран. При выделении мембранных структур, в частности плазматической мембраны, можно получить мембраны либо в виде листочков, либо в виде пузырьков. Последнее менее желательно, так как во фракцию мембран попадает и содержимое пузырьков, что затрудняет анализ. Повышение концентрации двухвалентных ионов позволяет выделять плазматические мембраны в виде листочков. Этого же эффекта можно добиться, вводя реактивы, связывающие мембранные SH-группы. Для предотвращения агглютинации очень важно соблюдать соотношение между количеством гомогенизируемого материала и объемом используемой среды. На качество гомогената могут оказать влияние самые неожиданные факторы, на первый взгляд незначительные: 33 фармакологические вещества, введенные животным незадолго до взятия материала, различные дезинфицирующие вещества, применяемые в виварии. Водные среды широко распространены и легко доступны. К недостаткам их относятся потеря и перераспределение водорастворимых компонентов, в основном белков. Так, долгое время активность ДНК-полимеразы I обнаруживалась только в цитоплазме. И лишь использование безводных сред при выделении ядер позволило обнаружить ее в ядре. Основой безводной среды являются органические растворители. Обычно используют смесь двух растворителей разной плотности: высокой и низкой. Для того, чтобы варьируя их относительную концентрацию, получать растворы нужной плотности. Безводные среды получили гораздо меньшее распространение. Они более сложны в работе и плохо воспроизводятся. А главное, их применение, вызывает потерю липидов – одного из основных компонентов мембран. Это, в свою очередь, также ведет к перераспределению белков между мембранами и внутри мембран, что вызывает нарушение ферментативных комплексов и потерю активности ферментов. Фракционирование Следует сразу подчеркнуть, что степень выделения и степень очистки – это разные вещи. Если нужно сохранить наиболее полный состав фракции, то приходится мириться с загрязнениями, если же главная задача – тщательная очистка от примесей, то неизбежны потери части компонентов. При проведении цитохимических исследований чистота фракций должна быть максимальной. Если это невозможно, то необходимо точно оценить количество примесей. Основным методом фракционирования является центрифугирование, которое проводится в несколько этапов. Первый этап – это грубое разделение гомогената на три фракции (Рис. 2): ядерную (600 – 1000 g, в течение 10 – 20 мин), митохондриальную (здесь же лизосомы и пероксисомы) (4 000 – 15 34 000 g, 5 – 20 мин) и микросомальную (надосадочная жидкость при выделении митохондрий). Ускорение, время центрифугирования, так же как и вязкость среды, подбирают для каждого конкретного случая. Рис. 2. Выделение клеточных органелл Второй этап фракционирования заключается в следующем. Полученная фракция наслаивается на градиент плотности (сахарозы) и центрифугируется в соотвтствии с плотностью и скоростью седиментации в течение различного времни (Рис. 3). Равновесное центрифугирование в градиенте плотности позволяет частично разделить митохондрии (плавучая плотность =1.228), 35 лизосомы (=1.238 – 1.245) и пероксисомы ( =1.255 – 1.260). Для лучшего разделения процедуру повторяют. Рис. 3. Центрифугирование в градиенте плотности Иногда прибегают к дополнительным обработкам для того, чтобы добиться лучшего разделения. Например, если речь идет о лизосомах, то используют присущую им особенность захватывать in vivo чужеродные вещества. Если в качестве такого вещества использовать тритон WR-1339, то «нагруженные» лизосомы будут флотировать. Если вводить животным предварительно декстран, препараты железа или коллоидное золото, то плотность лизосом будет значительно выше плотности других органелл. Методы центрифугирования постоянно совершенствуются и модифицируются. Кроме того, применяют и другие методы фракционирования: электрофорез, хроматографию, разделение в двухфазных системах, противоточное распределение. 36 Для определения степени чистоты полученной фракции используют биохимический и морфологический контроль. Для морфологического контроля осадок фракции подвергают фиксации и последующей обработке согласно методам приготовления препаратов для электронно-микроскопического анализа. Главные трудности связаны тем, что в большинстве случаев отсутствуют четкие морфологичские критерии различных фракций. Если речь идет о целых органоидах, то хорошо идентифицируются ядра, неплохо – митохондрии. Если же необходимо оценить чистоту субфракций органоидов, в частности мембран, то возможности идентификации ограничены небольшим числом специфических структур: поровых комплексов для ядерной оболочки, десмосом и ворсинчатых отростков для плазматической мембраны, рибосом для шероховатых микросом. Однако очень часто, особенно если фракция содержит обрывки мембран, определить их принадлежность по морфологическим признакам практичски невозможно. То же касается и пузырьков, которые образуются при разрыве мембран. В этом случае неидентифицированные пузырьки могут служить источником сильного загрязнения, так как мембраны, выворачиваясь, захватывают самое разное содержимое гомогената. Более полное представление о чистоте и однородности фракции дает биохимический контроль. Маркер данной субклеточной структуры может служить такой фермент, который локализован исключительно в этой структуре, прочно с ней связан и при разделении фракций не ингибируется и не подвергается активации. В настоящее время достаточно надежно установлена локализация некоторых ферментов, которые принято использовать в качестве маркеров (Рис. 4) Определяя активность таких ферментов, можно оценить полноту выделения фракции и степень ее загрязнения. Обычно фракция считается годной к работе, если степень ее обогащения маркером по сравнению с другими фракциями составляет 5 – 50 крат (для разных тканей, разных органоидов это отношение различное). Фракция считается чистой, если активность маркеров других фракций не превышает 1-5%. 37 При определении активности маркера учитывают, что она может меняться под действием различных компонентов среды: сахарозы (о ее влиянии на АТФазную активность шероховатых микросом говорилось выше), детергентов, ионов и т.п. Необходимо учитывать аппарат Гольджи α-маннозидаза II шероховатая ЭПС глюкозо-6-фосфатаза митохондрии цитохромоксидаза сукцинатдегидрогеназа пероксисома каталаза ядро ДНК рибосомы РНК плазматическая мембрана Na/K-АТФаза фосфодиэстераза лизосомы β-галактозидаза эндосома пероксидаза цитозоль L-лактатдегидрогеназа Рис. 4. Молекулы-маркеры субклеточных структур также изменение активности в результате хранения материала, таких процедур, как замораживание-оттаивание. Выявление маркерного фермента можно проводить не только по его активности, но и используя принципиально другой подход – иммунологический. Кроме того, маркерами могут служить наряду с естественными компонентами структур и искусственные метки. Так, маркером плазматических мембран могут являться так называемые метки – реактивы, которые ковалентно связываются лишь с поверхностными мембранами интактных клеток. 38 Анализ фракций На этом этапе очень важно оценить все возможности возникновения ошибок на предыдущих этапах: гомогенизации и фракционирования. Кроме того, здесь чрезвычайно полезным оказывается сравнение результатов, полученных разными способами выделения, очистки, а также сопоставление с электронно-микроскопическими картинами. В свою очередь, и на этом этапе применяются такие методы разделения фракций на составляющие их белки, липиды, полисахариды, нуклеиновые кислоты, такие как электрофорез, изоэлектрическая фокусировка, гель-фильтрация, ионообменная и афинная хроматография и другие. При их проведении также следует учитывать состав используемой среды, степень насыщения ионами, детергентами. Условия разделения определяется задачами исследования. Если нужно определить молекулярную массу составляющих компонентов, то необходимо как можно более тщательное их разделение (чтобы не идентифицировать какой-либо надмолекулярный комплекс как отдельную молекулу). При этом можно пренебречь изменением конформации белков. Если изучается биологическая активность молекулы (или ее выявление основано на определении этой активности), то условия выделения должны быть направлены на сохранение межмолекулярных связей, определяющих конформацию молекулы и ее реакционную способность. Существенным недостатком биохимических методов является их трудоемкость и плохая воспроизводимость при переходе на новый объект. Этим, в значительной мере, объясняется тот факт, что до настоящего времени изучению подлежит лишь ограниченное число тканей немногих видов организмов. Обычно исследователи предпочитают работать с «модельными» объектами. Например, при анализе свойств плазматических мембран используют «тени» эритроцитов. При изучении митохондрий – как правило, митохондрии сердечной мышцы крупного рогатого скота. Для мембран ЭПС источником служат клетки печени крысы или мыши. 39 Данные, полученные на ограниченном количестве объектов, распространяются на другие, при этом совсем не очевидно, что такое распространение правомочно. Не известно, какие из установленных фактов являются общими для всех организмов, а какие ткане- и видоспецифичны. Все описанные выше сложности и недостатки биохимических методов – следствие собственно этих методов. Они в большей или меньшей степени будут преодолеваться по мере совершенствования методик и оборудования. Но есть и принципиальный недостаток метода в целом – это усреднение полученных результатов. Одна из особенностей биологического материала – его неоднородность. Прежде всего, неоднородность, связанная с наличием в ткани разных типов клеток. Так, излюбленный объект биохимиков – печень млекопитающих, содержит примерно в равном количестве клетки двух типов: паранхиматозные (гепатоциты) и ретикуло-эндотелиальные (купферовские). Клетки одного морфологического типа также неоднородны. Уместнее говорить о них как о популяции клеток одного типа. И, наконец, существует внутриклеточная неоднородность различных структур, например, лизосомы - первичные и вторичные. Если говорить о гепатоцитах, в частности об их плазматической мембране, то она также структурно неоднородна: на границе между соседними гепатоцитами она содержит многочисленные десмосомы, в то время как в просвет канальцев обращена мембрана с множественными впячиваниями длинных ворсинчатых отростков, и, наконец, мембрана, граничащая с лакуной, имеет лишь небольшие выступы и впячивания. Если исследователя интересуют не усредненные характеристики «печеночной клетки», а вполне конкретные клетки и внутриклеточные структуры, то необходимо научиться сортировать анализируемый материал и хорошо идентифицировать его в первую очередь по морфологическим критериям. Например, можно подобрать такие условия гомогенизации, при которых будут преимущественно разрушаться более крупные и менее утойчивые к механическим воздействиям гепатоциты. Отделив неразрушенные клетки, мы получим гомогенат в основном из гепатоцитов. Используя особенность лизосом купферовских клеток накапливать 40 коллоидный йодид серебра в течение первого часа после инъекции, можно выделить фракцию лизосом только из этих клеток. Следует отметить, что нарушение организации клетки в результате гомогенизации не всегда приводит к необратимой потере информации о ее неоднородности. Если гомологичные компоненты разных клеток или органоидов значительно различаются по своим свойствам, то можно попробовать разделить, а потом идентифицировать их принадлежность к исходным структурам. Такой подход в свое время позволил установить, что гомогенаты селезенки содержат несколько популяций лизосом, повидимому происходящих из клеток разного типа. Аналогичная ситуация обнаружена при анализе плазматической мембраны эпителиальных клеток проксимальных извитых канальцев почки. Удалось выделить две фракции: со щеточной каемкой и без нее. Дальнейший анализ показал, что первая фракция содержит щелочной фосфатазы и мальтазы в 15 раз больше, чем вторая. На этом основании сделан вывод о том, что маркерные ферменты клеточной мембраны относятся не ко всей ее поверхности, а только к специализированным участкам. Появляются методы, позволяющие сортировать клетки перед их гомогенизацией. Так, с помощью противоточного распределения можно разделить ретикулоциты и эритроциты, поскольку они отличаются некоторыми характеристиками поверхностных мембран. В градиенте фиколл-пака удается разделить популяции тимоцитов. Особую ценность приобретают методы сортировки клеток, основанные на использовании проточного сортировочного цитоспектрофотометра. Отличающиеся по своим параметрам клетки (величина клеток, ядер, содержание ДНК, наличие определенных поверхностных мембранных антигенов и пр.) можно выделять в достаточном для биохимического анализа количестве (скорость сортировки может достигать 5 тыс. клеток в секунду). Ультрамикрохимические методы Принципиальный недостаток биохимических методов, связанный с усреднением результатов, снимается при переходе на 41 ультрамикромасштаб, т.е. при анализе единичных клеток или небольшого их числа. Однако развитие ультрамикрохимичеких методов было вызвано не этим соображением, а жизненной необходимостью, возникшей при изучении материала, который невозможно получить в достаточном для биохимического анализа количестве. Например, ткани человека, часто доступные только как биопсийный материал. Есть еще одна важная область биологии, где анализируемый материал представлен отдельными клетками, и где не обойтись без применения ультрамикрохимических методов - это биология развития. Сложности работы в ультрамикромасштабе начинаются уже на этапе получения материала. В зависимости от задач исследования, используют свежую или фиксированную ткань. Для изучения нуклеиновых кислот можно использовать предварительно фиксированный, обезвоженный и залитый в парафин материал. Отдельные клетки вырезают из толстых парафиновых срезов. При определении интенсивности анаэробного гликолиза или дыхательных процессов анализируемый материал должен подвергаться как можно меньшему количеству манипуляций. Отдельные клетки выделяют непосредственно из тонких срезов свежей ткани. Изучение НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ и трансаминаз можно проводить в клетках, выделенных из лиофилизированных срезов, полученных в свою очередь, в криостате при –20оС из замороженной ткани. Для выделения примняют специальные иглы или ножи: стальные, вольфрамовые, стеклянные. Выделение проводят под контролем широкоугольного микроскопа, при необходимости используют микроманипуляторы. После выделения клеток следует этап фракционирования клеточного содержимого с последующей идентификацией фракций. Обычно это микро- или нанограммы вещества. При манипулировании такими количествами веществами приходится работать либо с минимальными объемами достаточно концентрированных растворов или с привычными миллилитровыми количествами сильно разбавленных растворов. Последний вариант, 42 как правило, не приемлем: чувствительность существующих приборов не расчитана на малые концентрации вещества в растворах. Используется первый вариант. При этом следует учитывать, что резко возрастает отношение поверхности к объему. Поверхностные явления приобретают огромное значение - может произойти полное «растекание» анализируемой жидкости по поверхности пробирки или пипетки. Вот почему посуда, используемая для анализа, изготавливается из тефлона или гидрофобизированного стекла. При небольших объемах увеличивается роль диффузных явлений, которые, с одной стороны, очень сильно мешают разделению веществ, с другой – облегчают процедуру перемешивания растворов, а в объемах меньше 1 мкл даже полностью ее заменяют. Необходимо учитывать высокую скорость испарения. Быстрое испарение облегчает концентрирование вещества, и его можно проводить при пониженных температурах. В то же время испарение усложняет работу: приходится проводить процедуры в специальных влажных камерах, под слоем гидрофобной жидкости. Активное развитие ультрамикрохимических методов пришлось на 60-е годы прошлого века. С помощью этих методов были изучены изменения количества и нуклеотидного состава РНК, активность ряда фрментов в ходе оогнеза и раннего эмбриогенеза. Получены интересные данные об активности ферментов при дифференцировке различных клеток. Дальнейшее развитие методов работы с отдельными клетками требует как усовершенствования оборудования (в частности, необходимого для идентификации клеточных компонентов и определения их количества), так и создания принципиально новых подходов. Один из таких подходов был использован в конце 50-х начале 60-х годов 20 века для измерения активности дегидрогеназ, связанных с никотинамидадениндинуклеотидом (НАД+) или с никотинамидадениндинуклеотидфосфатом (НАДФ+). Он основан на возможности определения количества пиридиннуклеотидов по их флуоресценции при облучении ультрафиолетовым светом с длиной волны 470 нм. 43 Суть процедуры в следующем: после проведения реакции Субстрат НАД+ Фермент Продукт реакции . НАД Н Избыток НАД+ разлагают разбавленной щелочью, а количество НАД. Н, пропорциональное активности анализируемого фермента, измеряют флуорометрически после соответствующих обработок для образования интенсивно флуоресцирующего продукта. Этим методом может быть определено содержание пиридиннуклеотида в крупной нервной клетке (около 10-12 М). Для увеличения разрешающей способности метода предложена его модификация, которая получила название метода «циклирования». Метод «циклирования» После проведения первой реакции, во время которой образовался НАДФ.Н, избыток НАДФ+ разрушают нагреванием до 60оС, затем добавляют «циклирующий агент», содержащий глюкозо-6-фосфат, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, кетоглутарат, NH3 и глутаматдегидрогеназу. В присутствии НАД.Н реакции восстановительного аминирования -кетоглутарата и окисления глюкозо-6-фосфата следуют друг за другом в виде цикла: глутаматдегидрогеназа -кетоглутарат + NH3 глутамат + СО2 . НАДФ Н НАДФ+ 6-фосфоглюконат глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа глюкозо-6-фосфат 44 Используемые концентрации пиридиннуклеотидов значительно ниже констант Михаэлиса, и, следовательно, скорости реакций пропорциональны концентрациям НАДФ+ и НАДФ. Н. Инкубацию продолжают около 30 минут, затем реакционную смесь нагревают до 100оС. Реакции останавливаются, и пиридиннуклеотиды разрушаются. Остается измерить содержание образовавшегося 6-фосфоглюконата. Для этого проводят следующую реакцию: 6-фосфоглюконатдегидрогеназа 6-фосфоглюконат рибулозо-5-фосфат + . НАДФ НАДФ Н + СО2 Избыток НАДФ+ разрушают нагреванием до 60оС, а образовавшееся количество НАДФ.Н, эквивалентное содержанию 6-фосфоглюконата, измеряют флуорометрически. «Циклирование» не увеличивает ошибку метода. Применение метода «циклирования» позволяет измерять концентрацию пиридиннуклеотидов порядка 10-14 - 10-19 М. Вопросы для самоконтроля Перечислите основные этапы биохимического анализа клеток. В чем суть процесса гомогенизации? Какие требования предъявляют к гомогенату? Какие способы гомогенизации вам известны? Какой способ гомогенизации предпочтительнее при выделении плазматических мембран эритроцитов млекопитающих? 6. Растворы каких веществ чаще всего используются в качестве водной среды для гомогенизации клеток? 7. Что служит основой безводной среды для гомогенизации и фракционирования клеток? 8. Какая концентрация сахарозы используется чаще всего в качестве водной среды при гомогенизации клеток? 1. 2. 3. 4. 5. 45 9. Как осуществляют фракционирование содержимого клеток и тканей? 10. Что необходимо добавить в водную среду для гомогенизации, чтобы выделить плазматические мембраны в виде «листочков», а не в виде «пузырьков», т.к. содержимое последних будет загрезнять фракцию при дальнейшем анализе материала? 11. Какие вещества необходимо предварительно ввести животным, чтобы при фракционировании плотность лизосом была выше плотности других органелл? 12. Какое необходимо выбрать ускорение центрифуги для выделения митохондрий? 13. Как провести морфологический и биохимический контроль фракций? 14. Когда фракция считается «чистой»? 15. Какое соединение является маркером митохондриальной фракции? 16. Основные недостатки биохимических методов исследования. 17. Когда и почему используют ультрамикрохимический анализ? 18. Ультрамикрохимическое определение активности дегидрогеназ, связанных с НАД+ и НАДФ+. 19. Метод «циклирования» в ультрахимии. 20. Какой состав «циклирующего агента» используется для определения активности дегидрогеназ, связанных с НАД+ и НАДФ+, в методе «циклирования»? 46 Раздел 3. РАДИОАВТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Радиоавтографические методы – это методы, позволяющие избирательно пометить вещество еще при жизни организма, а затем, используя разные сроки взятия материала, проследить пути перемещения данного вещества в клетках и тканях, т. е. изучить клеточные процессы в динамике. Метод радиоавтографии впервые разработали Беланже (Belanger) и Леблон (Leblond) в 1946 г. Радиоавтографические методы состоят из трех этапов: 1. Включение изотопа 2. Распад изотопа с образованием ионизирующих частиц 3. Фоторегистрация ионизирующих частиц. Включение изотопа Изотоп вводится в организм обычно в составе вещества предшественника изучаемого синтеза. При выборе предшественника необходимо учитывать ряд требований: 1. Иметь по возможности полное представление о метаболическом пути вещества, выбранного в качестве предшественника. Вещество должено хорошо проникать в клетку. Оптимальным было бы его участие только в одной метаболической цепи. Синтезированное соединние должно быть стойким, чтобы исключить повторное включение меченого вещества. Следует хорошо знать сроки и пути выведения невключившегося предшественника из организма. При этом обязательно надо учитывать положение изотопа в молекуле предшественника, так как изотоп, находящийся в разных положениях, может иметь различную судьбу. 2. Изучить, как влияет введение той или иной дозы предшественника на метаболическую активность клетки. 3. Обязательно учитывать радиационный эффект меченого соединения. Он может проявляться в довольно значительном изменении клеточных параметров. 4. Все, о чем говорилось выше, следует обязательно проверять при переходе к новому объекту изучения, так как существуют 47 межтканевые и межвидовые различия в реакции клеток на одно и то же вещество. Типы меченых соединений, используемых для введения метки в различные химические соединения, содержащиеся в тканях. Нуклеиновые кислоты. Успехи радиоавтографии в изучении закономерностей клеточного цикла были получены во многом благодаря существованию 3Н – тимидина – предшественника синтеза ДНК, отвечающего большинству перечисленых требований. Для клеток печени мышей показано, что 3Н-тимидин хорошо проникает в клетки, быстро включается в синтез имено ДНК (примерно через 15-20 минут после внутрибрюшинного введения). Невключившийся 3Н-тимидин деградирует до продуктов, которые не могут служить предшественниками синтеза ДНК, и уже через час выводится из организма в виде тритиевой воды. В умеренных концентрациях введенный 3Н-тимидин не влияет на параметры клеточного цикла (в клетки разных тканей тимидин проникает с разной интенсивностью и поэтому одинаковые дозы введения в организм еще не свидетельствуют об одинаковых концентрациях его в разных клетках). И, наконец, радиационный эффект 3Нтимидина при кратковременных экспериментах незначителен. Белки. Обычно для введения метки в новосинтезируемый белок в качестве предшественника используют какую-либо аминокислоту, например лейцин, в которую вводят 3Н. Для включения метки в новосинтезируемый коллаген прекрасным предшественником служит пролин, меченный 3Н, т.к. эта аминокислота входит в состав коллагена. Углеводы. За синтезом гликогена можно проследить при помощи глюкозы, меченной 3Н. Если после иньекции меченой глюкозы радиоактивность регистрируется на контрольных срезах, но отсутствует на срезах, предварительно обработанных амилазой (фермент, расщепляющий гликоген), то обнаруженную радиоактивность можно отнести к этому полисахариду. Радиоактивность, сохраняющаяся в срезах после обработки их - 48 амилазой, обычно бывет обусловлена включением меченой глюкозы в гликопротеиды, протеогликаны, поскольку глюкоза может включаться в них так же, как и в гликоген. Липиды. Синтез липидов можно изучать методом радиоавтографии, если предварительно ввести в организм или культуру меченый ацетат или другой подходящий предшественник. Неорганические вещества. Фосфат кальция, отлагающийся в хряще или кости, можно пометить радиоактивными изотопами либо кальция (45Са), либо фосфора (32 Р). Железо, участвующее в образовании гемоглобина в процессе развития эритроцитов, можно пометить его радиоактивным изотопом (59Fe), что широко используется при изучении ряда болезней крови. В состав гормонов щитовидной железы входит йод, а поэтому можно проследить за синтезом этих гормонов, вводя в организм радиоактивный изотоп йода (131 I). Распад изотопа с образованием ионизирующих частиц Р а д о а к т и в н ы й р а с п а д представляет собой перегруппировку протонов и нейтронов в ядре нестабильного атома (изотопа), сопровождающуюся испусканием -, -частиц и -лучей. Приод полураспада изотопа – одна из его характеристик: С - 5 700 лет 3 Н - 12,5 лет 45 Са - 164 дня 35 S - 87 дней 14 Fe – 46 дней Р – 14 дней 131 I - 8 дней 59 32 Период полураспада определяет время экспозиции препарата перед проявлением эмульсии. От него также зависит время работы с изотопом (коротко живущие изотопы 32Р, 131I нельзя хранить). Скорость распада необходимо также учитывать с точки зрения техники безопасности, так как при длительной работе с долго живущими изотопами растет опасность загрязнения лаборатории. -лучи характеризуются очень высокой проникающей способностью и соответственно низкой степенью ионизации, на 49 регистрации которой основан метод радиоавтографии. -излучение можно обнаружить только при прямом столкновении с электронами. Выброшенный с орбиты в результате такого столкновения орбитальный электрон может быть зарегистрирован как -частица. Однако такое событие происходит крайне редко, и поэтому в радиоавтографии - излучение практически не находит применения. - и - частицы обладают рядом свойств (Табл. 2), которые удобны для регистрации. От массы частицы зависит форма трека, который она оставляет в фотоэмульсии. Тяжелые - частицы дают прямолинейные треки, а значительно более легкие - частицы при столкновении с атомными ядрами резко меняют направление и их треки имеют сложную неправильную форму. Таблица 2 Характеристики излучения - и -частиц Частица Масса, е.м. Заряд, е Скорость Энергия МэВ 4 +2 0.1 С 5,4 х10-4 -1 С Длина пробега Относительная иониза ция 3 –11 мкм 10 000 0,01 – 4 от мкм до мм 100 - частицы, испускаемые одним изотопом, имеют одинаковую энергию, в отличие от - частиц, для которых характерен непрерывный энергетический спектр с максимальной энергией, присущей каждому изотопу. Для - частиц 3H Еmax =18,5 кэВ, для 14 С – 155 кэВ, для 32Р – 1,7 МэВ. Относительная ионизация (I = e2/ v2), таким образом, у одного и того же изотопа будет одинаковой для всех - частиц и различной для - частиц. 50 Благодаря своей высокой ионизирующей способности - частицы, проходя через эмульсию, образуют сотни пар ионов, активируя практически каждый кристалл галоидного серебра, с которым встречаются на своем пути. Поскольку на образование пары ионов тратится 33 эВ, то - частица быстро теряет свою энергию и, таким образом, оставляемые ею треки будут короткими. Низкая ионизирующая способность - частиц приводит к тому, что они активируют далеко не каждый кристалл бромистого серебра (поэтому их треки будут состоять из редко расположенных зерен серебра); в результате энергия - частиц теряется медленно, и следовательно, длина пробега - частиц будет гораздо выше, чем у - частиц. Длина пробега и число образованных зерен серебра будут различны как у разных изотопов, так и среди - частиц, испускаемых одним изотопом (Табл. 3). Таблица 3 Изотопы Н Длина пробега в эмульсии 1 – 2 мкм Число образующихся зерен серебра 1 (редко 2) С около 20 мкм Р несколько мм 5-6 (близко расположенные) десятки ( редко расположенные) 3 14 32 Наилучшими для цитохимических целей характеристиками обладает тритий. Изотоп углерода применим для локализации веществ только в том случае, когда анализируются изолированные клетки и клеточные компоненты. 51 Фоторегистрация ионизирующих частиц Регистрация - и - частиц достигается фотографическим способом, суть которого заключается в следующем. Фотоэмульсия представляет собой взвесь микрокристаллов галоидного (обычно бромистого) серебра в желатине. Микрокристаллы обладают дефектами в кристаллической решетке в виде скоплений ионов. Эти скопления называют центрами чувствительности. Электроны, образовавшиеся при ионизации, перемещаются в зоне проводимости кристалла и собираются в центрах чувствительности (которые оказываются своеобразными ловушками электронов). В результате создаются пары электрон-дырка-биполяроид, которые, в свою очередь, притягивают к себе ионы серебра. Таким образом, на месте центров чувствительности создаются зародыши кристаллов серебра (размером от нескольких десятков до нескольких сотен атомов) – это центры скрытого изображения. Следующий этап – проявление эмульсии. Используют сильный восстановитель, который переводит бромистое серебро в металлическое с образованием бромистоводородной кислоты. Все ионы серебра могут быть восстановлены до атомов. Однако процесс восстановления идет гораздо быстрее в центрах скрытого изображения (чем больше центр, тем быстрее идет рост зерна серебра). Время проявления подбирается таким, чтобы видимые зерна серебра (их размер также зависит от времени проявления) сформировали только центры скрытого изображения, а размер зерен вне центра остался бы ниже разрешающей способности микроскопа. Расположение кристаллов бромистого серебра и зерен металлического серебра полностью не совпадает, так как рост зерна серебра идет от центра скрытого изображения (центра чувствительности) в случайном направлении. Образовавшееся «зерно» серебра в электронном микроскопе выглядит в виде извитой ленты (Рис. 5). Как правило, проявленные зерна серебра в несколько раз крупнее кристаллов бромистого серебра. Фиксация эмульсии проводится с использованием веществ, образующих с ионами серебра растворимое в воде соединение, 52 которое вымывается из эмульсии при промывке препарата. В эмульсии остаются только желатин и зерна металлического серебра. Рис. 5. Электронно-микроскопический радиоавтограф интерфазной эпителиальной клетки из крипты тонкого кишечника мыши (х 9 500). Эмульсии, применяемые в радиоавтографии, получили название ядерных (т.е. для регистрации ядерных распадов). Они отличаются от используемых в обычной фотографии меньшими зернами бромистого серебра (меньше 0.1 мкм, по сравнению с 0.5 – 1 мкм ) и их большей концентрацией в желатине (4:1, по сравнению с 1:1). Уменьшение размеров кристаллов бромистого серебра увеличивает разрешающую способность эмульсии, но снижает ее чувствительность, так как - частица может «проскочить» мелкий кристалл, не успев вызвать в нем ионизацию. Ионизация и, как следствие, образование центров скрытого изображения в кристаллах бромистого серебра могут происходить под действием не только энергии радиоактивного распада, но и любой другой: химической (воздействие клеток на эмульсию), тепловой (хранение радиоавтографических препаратов при 53 комнатной температуре), механической (сжатие эмульсии при быстром высыхании) и т.п. Зерна серебра, возникшие в таких случаях, получили название фона. Фон возрастает в эмульсии при длительном хранении, при неоднократном замораживанииразмораживании. Уничтожение фона проводят перед началом экспозиции эмульсии с препаратом, используя сильные окислители типа перекиси водорода. Наличие окислителей в атмосфере, где проводится экспозиция, может приводить к реокислению уже восстановленных зерен серебра в центрах скрытого изображения. Этот процесс (обратный возникновению фона) называется регрессией изображения. Регрессия происходит при длительных экспозициях. Особенно во влажных камерах и при повышенной температуре; в атмосфере с высоким содержанием кислорода. Регрессии в большей степени подвержены мелкозернистые эмульсии, которые из-за мелкозернистости являются низкочувствительными и требуют длительных экспозиций. Во избежание регресии изображения экспонирование проводят в холодильнике, в атмосфере углекислого газа и с использованием обезвоживающих агентов. В образовании фона и регрессии изображения может быть повинен и сам цитологический препарат. Для их предотвращения радиавтографический препарат предпочитают окрашивать после проявления эмульсии. От красителя требуется, чтобы он хорошо вымывался из желатина. Если окраске подвергается препарат до нанесения эмульсии, то краситель предварительно необходимо проверить на химическую нейтральность. С этой же целью клетки перед нанесением эмульсии иногда покрывают тонкими пленками, которые защищают эмульсию от химического воздействия препарата, но не мешают проникновению ионизирующих частиц. Особенно важно применение защитных пленок в электроно-микроскопической радиоавтографии, где используют низкочувствительные мелкозернистые эмульсии. При этом несколько снижается разрешающая способность метода, но это вынужденный копромисс. 54 Вопросы для самоконтроля 1. Радиоавтографические методы, основные этапы. 2. Требования, которые нужно учитывать при выборе веществапредшественника изучаемого синтеза в радиоавтографии. 3. Преимущества использования тимидина, меченного тритием в радиоавтографии. 4. Период полураспада наиболее часто используемых изотопов в радиоавтографии. 5. Каков период полураспада изотопа водорода - Н (трития)? 6. Характеристика α-, β- и γ- излучений. 7. Регистрация α-, β - частиц в радиоавтографии. 8. Можно ли различить радиоавтографы двух изотопов, если один испускает α-, а другой - β -частицы? 9. Какую форму трека оставляют α – частицы в фотоэмульсии? 10. Какова длина пробега в фотоэмульсии у изотопа водорода ³Н (трития)? 11. Ядерные эмульсии и их характеристика. 12. Какое соотношение бромистого серебра и желатина в ядерных эмульсиях, используемых в радиоавтографии? 13. Каково число образующихся зерен серебра в фотоэмульсии при использовании изотопа углерода (14С)? 14. Центры чувствительности и центры скрытого изображения в радиоавтографии. 15. Регрессия изображения в радиоавтографии и как ее избежать. 16. Что такое фон в эмульсии, как от него избавиться в радиоавтографическом исследовании? 17. Какие факторы могут вызвать появление фона в ядерных эмульсиях при авторадиографии? 55 Раздел 4. ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Иммуноцитохимические методы – это методы, основанные на использовании меченных антител для локализации компонентов (антигенов) ткани in situ. Основателями иммуноцитохимии принято считать группу исследователей, возглавляемых Альбертом Кунсом (Coons et al, 1941,1945; Coons, Kaplan, 1950). Именно они впервые получили антитела, меченные флуоресцентным красителем, и использовали для идентификации антигена на срезах ткани. Абсолютная специфичность реакции антиген-антитело дает возможность надежно идентифицировать компоненты ткани. Первый флуоресцентный краситель, который был использован для коньюгации с антителами, - флюоресцеинизоционат, что, повидимому, объясняется легкостью присоединения его молекул к антителам. При возбуждении соединений флуоресцеина светом = 490 нм наблюдается яркая яблочно зеленая флюоресценция. Развитие метода привело к появлению новых меток, например: родаминизотиоцианат (красный флюоресцентный краситель), стали использовать ферментативные метки. Первым ферментом была пероксидаза. Используют также щелочную фосфатазу и глюкозооксидазу. Конечные продукты реакций, катализируемых этими ферментами, путем специальной обработки можно сделать электронноплотными. Иногда для выявления иммуноцитохимической реакции на ультраструктурном уровне используют метки, сами по себе являющиеся электроноплотными, например коллоидное золото. Разработана методика мечения антител радиактивными элементами, в этом случае взаимодействие с антигеном регистрируют при помощи радиоавтографии. Получение антител Антитела, которые представлены главным образом глобулинами, получают при иммунизации кроликов (морских свинок) антигеном. Антиген должен быть совершенно чистым, (так 56 как только в этом случае можно рассчитывать на получение специфических антител) или синтетическим. Тем не менее, полученная сыворотка будет реагировать не только с молекулами антигена, введенного животным, но также с различными частями этих молекул, белком-носителем или его фрагментом. Сыворотка животного-донора содержит также множество естественных антител, которые могут реагировать с компонентами исследуемой ткани. Поэтому необходимо ставить строгий контроль и делать заключение, что обнаруживаемая иммунная реакция есть следствие специфического взаимодействия нужного антигена с антителами. Если молекулы антигена большие (иммуноглобулины) – их используют непосредственно для иммунизации. Если же молекулы антигена маленькие (многие пептиды) или не обладают антигенными свойствами сами по себе; то при иммунизации их необходимо вводить с большими молекулами. Маленькую молекулу (гаптен) химически присоединяют к большой белковой молекуле-носителю (например, бычьему сывороточному альбумину). Такой комплекс лучше стимулирует образование антител. В этом случае сыворотка животного донора будет содержать смесь антител, способных реагировать с разными участками аминокислотной цепи гаптена и молекулы-носителя. При этом антитела, узнающие носитель, либо просто не окрашивают исследуемую ткань, либо при необходимости могут быть удалены адсорбцией. Для этого к сыворотке добавляют белок, выполняющий функцию носителя (например, бычий сывороточный альбумин). По прошествии определенного срока с момента первичной иммунизации (обычно подкожной) кролику делают вторичную инъекцию антигена, после этого берут кровь для проверки на присутствие антител. Отобранную кровь центрифугируют для осаждения эритроцитов. Антитела остаются в плазме, которая строго говоря не является сывороткой (так как содержит нити фибрина), но все же препарат антител принято называть антисывороткой. Тестирование антител – проверка на наличие антител в сыворотке. Тестирование проводят при помощи ферментного 57 иммуносорбентного метода (ELISA – Enzyme-Linked-ImmunoSorbent Assay); путем радиоиммунологического анализа (RIA), однако самый лучший – это окрашивание заведомо «положительной» ткани (иммуноцитохимический метод). При иммуноцитохимическом методе тестирования можно сравнить специфическое окрашивание с фоном. Если фоновое окрашивание слишком сильное – использовать сыворотку нельзя. Этот анализ предпочтителен потому, что позволяет оценить авидность (липкость) антител. Антитела должны прочно связываться с антигенами, иначе могут быть вымыты из ткани в процессе ее окрашивания. Моноклональные антитела Проводят иммунизацию мышей, затем лимфоциты селезенки (клетки синтезирующие антитела) сливают с культивируемыми клетками мышинной миеломы. После слияния гибридные клетки продолжают расти и делиться в культуре и синтезировать антитела. Одна клетка продуцирует только один тип антител, поэтому в результате клонирования удается получить клеточную линию, секретирующую одинаковые антитела. Отбор нужных клонов проводят анализируя культуральные жидкости на присутствие антител при помощи RIA, ELISA, иммуноцитохимически. Таким образом, удается отобрать моноклональные антитела, узнающие отдельные участки молекулы. Моноклональные антитела хорошо хранятся. Смесь моноклональных антител, направленных к разным участкам молекулы, могут служить надежным иммунокрасителем. Моноклональные антитела используют не только, когда требуются чистые антитела к известному антигену, но и к неизвестным антигенам, которые могут служить маркерами определенных типов клеток и клеточных компонентов. Например: мышей иммунизировали тимоцитами человека, в результате клонирования был получен набор антител к Т-лимфоцитам человека. Эти антитела используют для иммуноцитохимического разделения клеток, принадлежащих к различным типам. Антитела узнают какие-то компоненты клеточной мембраны, однако химическая природа антигенов неизвестна. 58 Свойства хороших антител 1. Высокое сродство к антигену. Узнающие участки молекулы антитела должны быть хорошо подогнаны к антигенным участкам молекулы его специфического антигена, и при этом узнавать другие антигены. 2. Высокая авидность (сила связывания, липкость). 3. Высокий титр (разведение, концентрация антител). При высоком титре, за счет сильного разведения сыворотки во время окрашивания ткани, загрязняющие антитела могут быть выведены из реакции. В случае РИА, где разведение в 10 000 раз выше, чем при иммуноцитохимическом подходе, антитела взаимодействуют практически только со специфическими антигенами и побочные реакции неосуществимы. Условия, необходимые для проведения иммуноцитохимического исследования: 1. Сохранность антигена 2. Специфичность окрашивания 3. Хорошо охарактеризованный препарат антител 4. Удобная метка Для успешного окрашивания необходимо сделать тканевые антигены нерастворимыми, но при этом антигенные участки их молекул должны более или менее сохранять свою пространственную структуру и быть доступными антителами. Помимо этого нужно зафиксировать общую структуру ткани, чтобы после окрашивания на препарате можно было идентифицировать иммунореактивную клетку и органеллу. Методы фиксации используются самые разнообразные. Можно использовать альдегидные фиксаторы. Пептидные гормоны и нейропептиды хорошо сохраняются при высушивании замороженной ткани с последующей обработкой формальдегидом. Можно использовать парафиновые и криостатные свежезамороженные срезы. Выбор метода фиксации определяется спецификой конкретной реакции антиген-антитело и предполагаемой локализацией антигена. 59 Парафиновые срезы, приготовленные для окрашивания антителами нельзя сильно нагревать, т.к. могут пострадать антигенные детерминанты. Иммунофлуоресцентные методы Прямой метод Флуоресцеинтиоционат присоединяют прямо к специфичеким антителам. Меченную антисыворотку разводят физиологическим раствором, забуференным с помощью фосфата, а затем наносят на срез ткани и после инкубации несвязавшиеся антитела удаляют, промывая срез забуференным фосфатом физиологическим раствором. Окрашенные срезы просматривают в микроскоп с УФ оптикой, при этом в точке связывания наблюдается яблочно зеленая флуоресценция. Непрямой метод Имеет более широкое распространение. В этом случае за первыми специфическими немеченными антителами следует второй слой, содержащий антитела к - глобулинам животного, донора первых антител (например, козьи антитела к - глобулинам кролика, меченные флуоресцеинтиоционатом). Первые антитела (кроличьи) связавшиеся с участками среза ткани, содержащими нужный антиген, в свою очередь служат антигеном для вторых флюоресцентных антител. Иммуноферментные методы Пероксидаза впервые была использована для мечения антител в 1966 г и теперь во многих случаях применяется вместо флюоресцеина. Принцип метода непрямого окрашивания тот же, но антитела визуализируют при помощи гистохимической реакции на пероксидазу, в качестве субстрата (красителя) обычно используют диаминобензидин. Метод дает возможность иметь постоянные препараты, поскольку интенсивность окраски со временем не падает как при 60 флуоресцентном мечении. Препарат можно просматривать в обычный световой микроскоп и фотографировать. Метод «немеченных» антител Если непрямой метод является «двухслойным», то метод «немеченных» антител, предложенный L. A. Sternberger и соавт. “трехслойный”. Первый слой образован немеченными антителами (обычно кроличьими) к тканевому антигену. Второй слой – немеченными антителами (обычно овцы или козы) к иммуноглобулинам животного, у которого выработаны первые (специфические) антитела. Третий слой представляет собой антитела к метке, выработанные в животном того же вида, в котором получены антитела к тканевому антигену (обычно кролик). Таким образом, в третьем слое антитела связаны с меткой иммунологически. Следует отметить, что вторые антитела способны выполнять функцию мостика между первыми и третьими только при условии их избыточной концентрации по отношению к первым антителам. Метод немеченных антител, наиболее широко применяемый в иммуноцитохимии, имеет несколько модификаций в зависимости от используемой метки третьего уровня и характера ее связи с третьими антителами, одна из модификаций – пероксидаза-антипероксидазный метод (ПАП-метод). Пероксидаза-антипероксидазный метод В начале 70-х годов L.A.Sternberger и соавт. предложили использовать в качестве третьего уровня в технике немеченных антител пероксидаза-антипероксидазный (ПАП) комплекс. Этот комплекс образован молекулами пероксидазы, связанными с антителами к пероксидазе, выработанными в животном того же вида, которое было использовано для получения первых антител (обычно кролик). Этот метод характеризуется черезвычайно высокой чувствительностью, так как на каждую молекулу первого антитела приходится три молекулы пероксидазы (Рис.6), причем при иммунологическом образовании ПАП - комплекса активность 61 пероксидазы полностью сохраняется. С другой стороны, такая высокая концентрация пероксидазной метки позволяет существенно увеличить разведение первой антисыворотки, что, в свою очередь, приводит к резкому снижению концентрации Рис. 6. Схема проведения анализа с использованием ПАП - комплекса побочных антител (например, антител к примесям иммуногена) и падению фона. Низкий фон при использовании ПАП - метода также обусловлен высокой очисткой коммерческого ПАП - комплекса и блокированием потенциальных мест его неспецифического связывания тканью путем предварительной инкубации материала с нормальной сывороткой того вида животного, у которого были выработаны вторые антитела. Единственным недостатком ПАП- 62 метода является его относительная трудоемкость и расходование некоторых дополнительных реактивов. Конечным этапом иммуноцитохимической реакции является выявление маркерного фермента – пероксидазы хрена (ПХ) с помощью субстрата ферментативной реакции – перекиси водорода и хромогена. В процессе реакции образуется комплекс пероксидазы с перекисью, взаимодействующий с донором электронов, в результате чего образуется нерастворимый окрашенный продукт реакции и вода. В процессе этой реакции пероксидаза хрена не расходуется, то есть одна и та же молекула фермента может участвовать в образовании многих молекул конечного окрашенного продукта. ПХ + Н2 О2 ПХ . Н2 О2 ПХ. Н2 О2 + электрон донора нерастворимый продукт + Н2 О + ПХ В качестве донора электрона чаще всего используются 3,3/ – диаминобензидинтетрагидрохлорид (ДАБ), обеспечивающий образование темно-коричневого нерастворимого осадка в месте реакции (Рис.7). Важным преимуществом ПАП - метода, с последующим выявлением ДАБ-продукта гистохимической реакции, является возможность увеличения его оптической плотности (в основном за счет осаждения в местах реакции таких металов, как кобальт, никель, серебро, золото, осьмий). Такого рода интенсификация позволяет: с одной стороны, существенно увеличить разрешающую способность иммуноцитохимического метода, а с другой – использовать его для «двойного» мечения (выявить на одном и том же срезе два или более антигена, содержащихся как в разных клетках, так и в пределах одной и той же клетки). Двойное мечение прямым методом В этом случае два антигена выявляют с помощью двух первых антител, меченных различными флуорохромами, например, флуоресцеином и родамином. Дальнейшее использование соответствующих красителям фильтров позволяет различить метки и, таким образом, локализовать оба антигена на срезах. Этот метод, 63 однако, малоэффективен в случае значительного преобладания внутриклеточного содержания одного антигена над другим, так как при этом одна метка маскирует другую. А Б Рис. 7. Гормонреактивные структуры в дорсолатеральной части паравентрикулярного ядра гипоталамуса крысы, выявленные ПАП – методом с коньюгацией ДАБ. А – реакция с антисывороткой к вазопрессину; Б - реакция с антисывороткой к окситоцину Двойное мечение непрямым методом Непрямой метод предполагает использование двух видов первых антител соответственно к двум разным антигенам. Первые антитела выявляются вторыми антителами с различной меткой. Необходимым условием применения этого метода является использование первых антител, полученных у различных видов животных, и отсутствие перекрестной реакции у вторых – меченных антител. В этом методе в качестве первых антител можно также использовать моноклональные антитела, относящиеся к различным классам иммуноглобулинов. 64 Комбинация иммуноцитохимии с другими гистохимическими методами Использование комбинации иммуноцитохимии с другими гистологическими и физиологическими подходами позволяет решить принципиально важные проблемы фундаментальной и прикладной науки. Например, комбинация иммуноцитохимии с гистофлюоресцентным или радиоавтографическим выявлением моноаминов широко используется для двойного мечения пептид- и моноаминергических структур мозга с целью изучения их структурно-функциональных взаимоотношений. Сочетание иммуноцитохимии с техникой маркеров аксоплазматического транспорта обогатило нейронауки в познании специфических нервных связей между различными отделами головного и спинного мозга. Вопросы для самоконтроля 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. Какова особенность иммуноцитохимических методов? История развития иммуноцитохимических методов. Какой краситель использован первым для коньюгации с антителами в иммуноцитохимии? Иммунофлюорисцентные методы: прямой и непрямой. Какой цвет флюоресценции наблюдается при использовании антител, меченных флюоресцеинизоционатом в местах их коньюгации с антигеном? Иммуноферментные методы и их преимущества. Какие ферменты используют в качестве метки антител в иммуноцитохимии? Пероксидазо-антипероксидазный метод (ПАП - метод). Как получают антитела? Как провсти тестирование антител? Какими свойствами должны обладать хорошие антитела? В чем преимущество моноклональных антител? Что такое авидность антител? 65 Раздел 5. КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ Количественные оценки клеточных параметров не только помогают глубже понять уже известные процессы, но и открывают принципиально новые явления. Можно вспомнить хотя бы пример установления различий в содержании ядерной ДНК у разных организмов, за которым последовала многочисленная серия работ, доказавших генетическую роль ДНК. Возможно, именно благодаря первым впечатляющим результатам количественная цитохимия долгое время развивалась как абсорбционная цитофотометрия нуклеиновых кислот, преимущественно ДНК. Только в последние десятилетия стали активно проводиться количественные исследования других компонентов клетки. Спектрофотометрия Спектрофотометрия связана с явлением поглощения света исследуемым веществом В основе абсорбционной фотометрии лежит закон Бугера-Бэра, устанавливающий экспоненциальное соотношение между поглощением монохроматического света и количеством поглощающего материала, через который проходит свет. В простейшей форме закон можно записать в следующем виде: Ф = Фо . 10-kcd; где Фo – световой поток, вошедший в среду; Ф – световой поток, успешно прошедший в среде с концентрацией вещества с и показателем поглощения k путь d. Отношение величины светового потока, прошедшего через среду, к потоку, вошедшему в среду, называется пропусканием. Пропускание можно установить, измеряя интенсивность светового потока, прошедшего через среду, -I и соотнося ее с интенсивностью светового потока, прошедшего рядом с измеряемым объектом – Io: 66 I/Io = Ф/Фо = 10 -kcd Пропускание меняется от 0 до 1. Логарифм пропускания, взятый с обратным знаком, называется оптической плотностью вещества (D): D = lg I/Iо = - lgФ/Фо ; D = kcd Оптическая плотность меняется от 0 (полное пропускание) до бесконечности (полное поглощение). Если нужно определить массу вещества (m), а не его концентрацию, то вводим в формулу площадь поля (S), через которое проходит свет: D = kcdS / S = km / S. Если известен показатель поглощения k, то можно определить абсолютное значение массы вещества. Чаще всего показатель поглощения неизвестен, и поэтому определяется относительное количество вещества. Принципиальная схема устройства цитоспектрофотометра показана на Рис.8. К постоянству источника света, к качеству монохроматора и линз микроскопа предъявляют очень жесткие требования. Кроме фотоэлектрического существует и не получивший широкого распространения фотографический способ регистрации светового потока, при котором измерение переносится на увеличенную фотографию клетки, выполненную при освещении ее светом определенной длины волны. Предполагается, что степень почернения эмульсии соответствует плотности вещества в данном участке клетки. При всех легко обнаруживаемых недостатках фотографического способа у него есть и некоторые преимущества, например визуализация УФ - поглощения. При адаптации спектрофотометрии, основанной на работе с гомогенными растворами, в специфике цитохимии обнаружились существенные трудности, связанные с неравномерным 67 распределением веществ в клетке. Оказалось, что это приводит к значительным о ш и б к а м р а с п р е д е л е н и я. При снижении оптической плотности ошибка распределения уменьшается. Однако прозрачные объекты дают большую ошибку за счет ошибки аппаратуры, т.е. сильно увеличивать прозрачность объекта нельзя. Существуют метды, позволяющие снизить ошибку распределения: плаг-метод, сканирвание, двухволновой метод. источник моно света хроматор конден сор объект объектив делитель ная линза окуляр ФЭУ Регистрирующий прибор Рис. 8. Схема устройства цитоспектрофотометра П л а г-метод Измерение оптической плотности проводят на относительно гомогенном «типичном» участке клетки и экстраполируют результат на всю площадь. При этом возникает ряд вопросов: насколько типичен выбранный участок; как подсчитать объем ядра, если оно не идеальной сферической формы; как учесть разную толщину препарата? Проблему «типичности» можно решить, измеряя несколько участков и усредняя результаты 68 (м н о г о т о ч е ч н ы й метод). Ошибка плаг-метода и многоточечного больше 10 %. Сканирование Это планомерное измерение узким зондом всей поверхности объекта. Движение зонда может быть скачкообразным или нерерывным в зависимости от системы автоматического передвижения зонда и препарата относительно друг друга. Регистрация оптической плотности также автоматическая с последующим интегрированием. Ошибка метода сканирования около 1%. Ограничение применения сканирующих фотометров связано со сложностью приборов (катодно-лучевые трубки, подвижные диафрагмы), а также с тем, что на результаты измерения сильно влияют размеры зонда и толщина препарата. Двухволновой метод Измеряется среднее пропускание целого объекта (ядра, клетки), но делают не одно, а два измерения при разных длинах волн. Эти длины подбираются таким образом, чтобы соответствующие показатели поглощения соотносились определенным образом, например k1 = 2k2 или 2k1=3k2. Если длины волн подобраны с соблюдением этого условия, то можно сотавить систему из двух уранений с двумя неизвестными, которая успешно решается. Ошибка двухволнового метода обычно составляет 2-5%, Еще одна трудность цитофотометрии связана с абсорбционными свойствами клеток. Собственным поглощением обладают лишь немногие клеточные компоненты, важнейшие из них (нуклеиновые кислоты и белки) – в УФ области спектра. Содержание циклических аминокислот в разных белках различно, поэтому цитофотометрия белков в УФ области не очень точна и развита слабо. Нуклеиновые кислоты находятся в преимущественном положении. УФ цитофотометрия в сочетании с методами дифференциальной экстракции успешно используется для дублирования цитофотометрических измерений в видимой области спектра. Фотометрия в видимой области спектра – это в основном фотометрия красителей. На первое место здесь выступает специфичность красителей. Их немного: реактив Шиффа, прочный зеленый, соли тетразолия, проционовые красители и некоторые другие. Однако, встает вопрос, соответствует ли количество 69 связавшегося красителя количеству вещества в клетке? Этот вопрос очень подробно изучен для комплекса ДНК-фуксин, образующегося при реакции Фельгена. Оказалось, что содержание ДНК-фуксина зависит от очень многих условий. Прежде всего на него влияют в р е м я и у с л о в и я г и д р о л и з а. Оптимальным является такое время гидролиза, при котором выявляется максимальное содержание ДНК-фуксина. Подъем кривой гидролиза отражает процесс отщепления пуриновых оснований, а ее спад – деградацию ДНК. На содержание ДНК-фуксина влияет п р о ц е с с ф и к с а ц и и; с п о с о б ы приготовления препаратов, использование разных предобработок. Различаются кривые гидролиза, проведенного в одних и тех же условиях, но для клеток разных тканей, а также для клеток одного и того же типа, но находящихся в различном функциональном состоянии. Количественные методы все активнее внедряются в цитохимический анализ. Использование флуоресцентных красителей делает их применение возможным и для веществ, находящихся в клетке в небольших количествах. Однако применение флуоресцентных красителей для количественных оценок требует дополнительных контрольных процедур, учитывающих природу флуоресценции (тушение флуоресценции, невозможность измерения свечения внутренних слоев клетки, так как верхние слои работают как поглощающий фильтр). Проточная цитофотометрия Золотой век фотометрии начался с появлением проточного цитофотометра, во много раз увеличивающего скорость и точность измерительных процедур. Проточная цитофотометрия позволяет регистрировать сразу несколько клеточных параметров (например, содержание ДНК, размер клеток и их форму или общее содержание ДНК и содержание АТ- и ГЦ-богатых последовательностей). Можно получать одновременно до 6 характеристик. Это достигается применением светорассеяния под разными углами, возбуждением и флуоресценцией в двух длинах волн. 70 Одна из модификаций проточного цитофотометра позволяет сортировать клетки, обладающие разными свойствами. Возможность сортировки достигается быстротой анализа клеточных характеристик (с помощью компьютера) так, что на выходе из вибрирующей форсунки та капля, в которую попала клетка с заданными свойствами, заряжается положительно или отрицательно, а затем под действием электромагнитного поля отклоняется и попадает внужную пробирку. Одновременно происходит разделение на 3 фракции. Если вместо клеточной суспензии взять суспензию хромосом, то можно успешно выделить определенные хромосомы, а затем использовать их для выделения ДНК с целью создания библиотек клонов ДНК, принадлежащей известным хромосомам. Проточный микрофлуориметр (Рис. 9) анализирует клетки в суспензии в струе жидкости, которую пересекает луч лазера. Чтобы сконцентрировать клетки в центральной части струи и уменьшить число агрегатов, способных забить выходное отверстие проточной камеры, используется техника тока обтекающей жидкости («рубашки»). Клетки по металлическому патрубку под давлением подаются в проточную камеру, которая промывается током обтекающей жидкости. Обтекающая жидкость с клетками выходит из камеры через апертуру, размер которой определяет диаметр выходящего потока жидкости. Частоту поступления клеток в обтекающую жидкость можно варьировать, меняя разницу в давлении между обтекающей жидкостью и вводимым образцом. Этот прием в сочетании с подбором концентрации клеток в образце позволяет создать такие условия, при которых каждая отдельная клетка последовательно проходит точку пересечения лазерного луча со струей жидкости (Рис. 9). Источником света в проточных микрофлуориметрах служат лазеры, обычно аргоновые, но встречаются также гелий-неоновые и криптоновые. Лазеры служат источником высоко коллимированного (параллельные световые волны), монохроматического света большой интенсивности, который можно сфокусировать для передачи значительной энергии анализируемым клеткам. Как правило, аргоновые лазеры настраивают на длину волны излучения 488 нм, что обеспечивает 71 Сигнал флуоресценции Ультразвуковой генератор Проточная камера Обтекающая жидкость Патрубок подачи образца Точка пересечения лазерного пучка Струя жидкости в воздухе, содержащая клетки Фильтр Линза детектора флуоресценции Испускаемый свет Сигнал светорассеяния Линза детектора светорассеяния Рассеянный свет Запирающая полоска Лазерный пучок + + + Отклоняющие пласины + + ++ + + Точка отрыва капель - + ++ + + ++ + - - -- - Рис. 9. Схематическое изображение лазерного сортировщика клеток. 72 оптимальное возбуждение молекул флуоресцеина, используемого для мечения антител. Если используется техника анализа по двум параметрам, то второй лазер фокусируется на струе жидкости несколько ниже точки пересечения лучом первого лазера. Этот второй лазер настраивают на длину волны 568 нм, вызывающую максимальное возбуждение молекул красителя техасского красного, кторый используется для промечивания антител при анализе по двум параметрам. Другие биологические красители, такие, как акрифлавин, митромицин, бромид этидия, йодид пропидия, характеризуются поглощением в пределах длин волн, испускаемых аргоновым лазером. С помощью этих красителей определяют содержание ДНК в индивидуальных клетках. Клетки поступают в проточную камеру микрофлуориметра по трубке для подачи образца под давлением (Рис. 9), превышающим давление обтекающей жидкости. Клетки подхватываются ламинарным потоком обтекающей жидкости, и со струей выбрасываются из выходного отверстия проточной камеры. Когда клетка в токе жидкости пересекает лазерный луч, то он отклоняется. Такой рассеянный свет фокусируется линзой детектора светорассеяния и регистрируется на фотоумножителе (ФЭУ). Если клетка несет флуоресцентный краситель, то при пересечении лазерного пучка происходит испускание света (в результате возбуждения молекул красителя излучением лазера). Свет, испускаемый клеткой при возбуждении молекул красителя, проходит через фильтр, исключающий регистрацию лазерного излучения фотоумножителем детектора флуоресценции. Этот ФЭУ регистрирует излучение, испускаемое клеткой. На основе характеристик светорассеяния и флуоресценции может происходить сортировка клеток. С этой целью, под действием ультразвука на проточную камеру струя жидкости «разбивается» на капли. Эти капли могут быть избирательно заряжены при подаче заряда на струю жидкости непосредственно перед образованием капли. Если клетка обладает свойствами, соответствующими отклонению («селекции») в левом направлении, то на струю будет подаваться положительный заряд, как только клетка достигнет точки отрыва капель, и тогда положительно заряженная капля с 73 соответствующей клеткой будет отклоняться влево прохождении через заряженные отклоняющие пластины. при Вопросы для самоконтроля Какое явление лежит в основе фотометрии? Спектрофотометрический анализ клеток и тканей. Закона Бугера-Бэра. В каких пределах меняется оптическая плотность вещества? В каких пределах изменяется оптическое пропускание? Устройсто цитоспектрофотометра. В чем суть фотографического способа регистрации светового потока? 8. Методы фотометрии: многоточечный, сканирование, двухволновой. 9. Какова ошибка измерения при использовании метода сканирования в фотометрии? 10. Какие факторы влияют на количество красителя, связавшегося с определяемым веществом (на примере ДНК-фуксина)? 11. Принцип действия проточного микрофлуориметра. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 74 Рекомендуемая литература 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. Автондилов, Г.Г. Медицинская морфометрия. - М.: Медицина, 1990. Агроскин, Л.С., Папаян, Г.В. Цитофотометрия. - Л.: Наука, 1977. Биохимические основы жизнедеятельности человека: учеб. пособие для студентов вузов / [Ю.Б. Филиппович, А.С. Коничев, Г.А. Севастьянова, Н.М. Кутузова].- М.: Гуманитар. Изд. центр ВЛАДОС, 2005. Волкова, О.В., Елецкий, Ю.К. Основы гистологии с гистологической техникой. - М., 1982. Иванов, В.Б. Активные красители в биологии.- М.: Наука, 1982. Иммунология. / Под ред.У. Пола, М.: Мир, 1989. Камышников, В.С. Клинико-биохимическая лабораторная диагностика: Справочник: В 2-х т.-2-е изд. - Мн.: Интерпрессервис, 2003. Кисели, Д. Практическая микротехника и гистохимия. Будапешт, 1962. Клиническая биохимия./ Под ред. В.А. Ткачука.-М.:ГЭОТАРМЕД, 2002. Кольман, Я., Рем, К.-Г. Наглядная биохимия. 2-е изд.: Пер. с нем. – М.: Мир, 2004. Комов, В.П., Шведова, В.Н. Биохимия: Учеб. для вузов - М.: Дрофа, 2004. Основы гистологии и гистологической техники. Под ред. В.Г. Елисеева и др. / М.: «Медицина», 1967. Пирс, Э. Гистохимия (теоретическая и прикладная). - М.: Изд- во иностр. ли – ры, 1962. Полак, Дж., С. Ван Норден Введение в иммуноцитохимию: современные методы и проблемы. - М.: Мир, 1987. Справочник биохимика: Пер. с англ. / Досон Р., Элиот Д., Элиот У., Джонс К. – М.: Мир, 1991. Ташке, К. Введение в количественную цито - гистологическую морфологию. - Румыния, 1980. Хэм, А., Кормак, Д. Гистология. - М: Мир, 1983. 75 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ……………………………………………………….......3 Раздел I. АНАЛИТИЧЕСКАЯ МИКРОСКОПИЯ………...........4 Прижизненное изучение локализации химических веществ…….5 Цитохимический анализ фиксированного материала …………...7 Химические способы фиксации …………………………………..8 Физические способы фиксации ………………………………….11 Уплотнение материала и приготовление срезов ………………..14 Общие принципы идентификации веществ в клетке ………….19 Метахромазия ……………………………………………………..24 Специфичность выявления внутриклеточных веществ ……......25 Раздел II. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ……………………30 Гомогенизация клеток…………………………………………….30 Фракционирование………………………………………………..33 Анализ фракций…………………………………………………...38 Ультрамикрохимические методы ………………………………..40 Метод «циклирования» …………………………………………...43 Раздел III. РАДИОАВТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ……...46 Включение изотопа………………………………………………..46 Распад изотопа с образованием ионизирующих частиц………..48 Фоторегистрация ионизирующих частиц………………………..51 Раздел IV. ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ……55 Получение антител………………………………………………..55 Моноклональные антитела………………………………………57 Иммунофлуоресцентные методы…………………………….......59 Иммуноферментные методы …………………………………….59 Метод «немеченных» антител……………………………………60 Пероксидаза-антипероксидазный метод ………………………..60 Комбинация иммуноцитохимии с другими гистохимическими методами…………………………………….64 Раздел V. КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ ……………………65 Спектрофотометрия……………………………………………….65 Проточная цитофотометрия………………………………………69 Рекомендуемая литература……………………………………….74 76 Злобина Надежда Афанасьевна ЦИТОГИСТОХИМИЯ Учебно-методическое пособие для студентов высших учебных заведений Редактор Подписано в печать 25.12.2009 г. Формат 60-84 1/16. Бумага офсетная №1. Печать офсетная. Печ. л. _5,0 Уч.-изд. л. ____ Тираж 100 экз. Заказ № _________ ГОУ ВПО «Кемеровский государственный университет», 2010 650043, Кемерово, ул. Красная, 6. Отпечатано в типографии издательства «Кузбассвузиздат». 650043, Кемерово, ул. Ермака, 7. 77
